RAD23B基因rs10759225位點多態(tài)性與含鉑類方案治療非小細胞肺癌療效和血液學(xué)毒性的關(guān)系

謝曉楠 文貽勇 凌瓊穎 黃文鋒 覃芳卉 王洪學(xué) 周文獻 陸永奎 謝裕安 謝偉敏

對于無法接受酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）治療或TKIs治療失敗后的進展期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者，含鉑類聯(lián)合方案是有效的治療措施，能顯著改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后［1-3]，而DNA修復(fù)通路相關(guān)基因的表達狀況或遺傳變異被認為是影響含鉑類方案療效的重要因素［4-6]。本課題組在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者接受含鉑類方案化療后其外周血中RAD23B mRNA的表達水平可能與其對鉑類藥物的敏感性有關(guān)。RAD23B基因是DNA修復(fù)通路的關(guān)鍵點，可影響腫瘤細胞對順鉑等藥物的敏感性［7-8]。研究顯示，RAD23B基因的單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotide polymorphism，SNP）與肝癌等多種腫瘤的遺傳易感性有關(guān)［9-11]，但其與含鉑類方案治療NSCLC的療效及不良反應(yīng)的關(guān)系尚不明確。為此，本研究探討RAD23B基因rs10759225位點多態(tài)性與含鉑類方案一線治療晚期NSCLC患者的療效及血液學(xué)毒性的關(guān)系，為闡明兩者關(guān)系提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

從本課題組前期建立的肺癌患者臨床資料庫及外周血樣本庫中選擇2005年9月—2009年8月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院治療的NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)病理組織學(xué)或細胞學(xué)確診為NSCLC；⑵年齡18～70歲，美國東部腫瘤協(xié)作組（eastern cooperative oncology group，ECOG）評分 0～2分，預(yù)計生存期≥3個月；⑶TNM分期Ⅲ～Ⅳ期；⑷有化療適應(yīng)證且接受含順鉑（Cisplatin，DDP）或卡鉑（Carboplatin，CBP）方案一線化療，包括無表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）突變的初治患者，或有突變但接受TKIs治療后進展且未接受過化療者，或既往手術(shù)和輔助治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者（無進展生存期≥1年）；⑸入組時血常規(guī)、肝腎功能和心電圖檢查等指標(biāo)均基本正常，無化療禁忌證；⑹至少有1個經(jīng)CT等影像學(xué)檢查確定的可測量病灶；⑺自愿接受治療并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴有癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移；⑵心、肝、肺、腎等重要器官功能不全，無化療適應(yīng)證；⑶無法評價療效和血液學(xué)毒性者。本研究已獲得廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 治療方案

入組患者接受的含鉑類方案包括多西他賽聯(lián)合鉑類（DC方案）、培美曲塞聯(lián)合鉑類（PC方案）、吉西他濱聯(lián)合鉑類（GP方案）或長春瑞濱聯(lián)合鉑類（NP方案）等。鉑類藥物使用方法：DDP 25 mg/m2，d1～d3；或CBP曲線下面積（AUC）=5，d1。多西他賽、培美曲塞、吉西他濱等其他化療藥物的劑量和使用方法按常規(guī)。各化療方案均以21 d為1個周期。除非出現(xiàn)疾病進展或患者不能耐受，否則至少化療2個周期（最多6個周期）。化療期間按常規(guī)給予5-羥色胺3受體（5-HT3R）拮抗劑聯(lián)合地塞米松止吐，注意保護心、肝、腎功能，必要時使用粒細胞集落刺激因子防治粒細胞減少癥等。

1.3 總DNA提取

所有入組患者均在接受含鉑類方案化療前抽取外周血2～5 mL，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。采用基因組DNA提取試劑盒按說明抽提總DNA，紫外分光光度儀檢測DNA濃度及純度，將符合要求的基因組DNA在-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR及基因型檢測

通過My Sequenom網(wǎng)頁設(shè)計rs10759225位點的PCR擴增引物，序列：上游引物為5'-GAGGGGTTTTGCGCACACG-3'；下游引物為 5'-TTTCTCACATTCC-ACTCATTCCTCA-3'，引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20μL，其中含樣本DNA和多重PCR引物各1μL，其余同常規(guī)PCR反應(yīng)。PCR擴增條件：95 ℃ 預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，65 ℃退火40 s，72℃ 延伸90 s，共36個循環(huán)；72℃延伸2 min。擴增片段長度為400 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，進行連接反應(yīng)（94℃ 1 min，56℃ 4 min，38個循環(huán)）。采用改良多重高溫連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)（上海天昊生物科技有限公司遺傳分析中心）進行基因分型：取連接產(chǎn)物0.5μL，與Liz500 SIZE STANDARD 0.5 μL和Hi-Di 9 μL混勻，95℃變性5 min，然后使用 ABI3730XL測序儀檢測，采用 GeneMapper 4.1（Applied Biosystems，USA）對收集的原始數(shù)據(jù)進行分析。

1.5 療效和不良反應(yīng)評價

每2個周期采用實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）1.1 版進行療效評價［12]，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進展（progressive disease，PD）。有效率（overall response rate，ORR）=（CR+PR）/總例數(shù)×100%，疾病控制率（disease control rate，DCR）=（CR+PR+SD）/總例數(shù)×100%。將CR和PR定義為化療有效，將SD和PD定義為化療無效。無進展生存期（progress-free survival，PFS）定義為從含鉑類方案化療開始到腫瘤出現(xiàn)進展的時間。每個周期采用通用不良事件術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)4.0版（CTCAE 4.0）［13]評價不良反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。采用χ2檢驗比較不同基因型病例組之間ORR和血液學(xué)毒性發(fā)生率的差異；采用比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）描述基因型與ORR及血液學(xué)毒性的關(guān)聯(lián)強度，以非條件Logistic回歸模型計算OR和95%CI，并校正潛在混淆因素：性別、年齡、吸煙狀況、ECOG評分（0～1分與2分）、TNM分期（Ⅲ期與Ⅳ期）、腫瘤組織學(xué)類型（鱗癌與非鱗癌）、放療史、輔助化療史、化療方案以及TKIs治療史。通過Kaplan-Meier繪制曲線，采用Log-rank檢驗比較不同基因型患者PFS的差異。采用雙側(cè)概率檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者的臨床資料

共150例NSCLC患者符合入組條件。中位年齡55歲（22～70歲）；男性 106例，女性 44例；既往使用TKIs治療后進展12例。其余詳細資料見表1。

表1 150例非小細胞肺癌患者的臨床資料Tab.1 Clinical data of 150 patients with non-small cell lung cancer

2.2 基因分型結(jié)果

所有樣本均分型成功，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.276）。各基因型的頻率：G/G基因型 52.0%（78/150），G/A 基因型 40.0%（60/150），A/A基因型8.0%（12/150）；A等位基因型（G/A和A/A基因型）48.0%（72/150）。

2.3 療效

全部患者均完成至少2個周期化療，中位化療周期數(shù)為3個（2～6個周期），均可評估客觀療效，其中獲CR 3例（2.0%）、PR 40例（26.7%）、SD 66例（44.0%）、PD41例（27.3%），ORR為43例（28.7%）。Ⅲ期患者ORR為 35.7%（20/56），高于Ⅳ期患者的 24.5%（23/94），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.171，P=0.141）。使用GP方案化療的患者占54.7%，但其ORR與其他方案組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。組織學(xué)類型為非鱗癌、ECOG評分0～1分、有TKIs治療史患者的ORR均高于對應(yīng)亞組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 rs10759225位點多態(tài)性與化療療效的關(guān)系

以GG基因型為參照，A等位基因型在治療有效組中的頻率顯著高于無效組，攜帶A等位基因型患者對含鉑類方案的敏感性是攜帶G/G基因型患者的1.78 倍（OR校正=1.780，95%CI：1.110～2.884，P=0.042），見表2。

表2 rs10759225位點多態(tài)性與化療療效的關(guān)系［n（%）] Tab.2 Relationship between rs10759225 polymorphism and efficacy of chemotherapy［n（%）]

2.5 rs10759225位點多態(tài)性與預(yù)后的關(guān)系

隨訪至2016年12月31日，全組患者均可評價PFS，完成PFS隨訪后有35例失訪，由于失訪率過高，無法評價全組總生存期（overall survival，OS）。全組中位無進展生存期（mPFS）為 5.6個月（95%CI：5.0～6.2個月）。G/G基因型患者mPFS為5.0個月（95%CI：3.3～6.7個月），G/A 基因型為 5.6個月（95%CI：3.6～7.6個月），A/A 基因型為 7.5個月（95%CI：4.7～10.3個月），A等位基因型為6.0個月（95%CI：5.2～6.8個月），各組PFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.537）。其中，A/A基因型患者的mPFS較G/G基因型患者延長2.5個月，但差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.314），見圖1。

2.6 rs10759225位點多態(tài)性與化療相關(guān)血液學(xué)毒性的關(guān)系

2.6.1 rs10759225位點多態(tài)性與白細胞減少的關(guān)系 所有入組患者均可評價血液學(xué)毒性。白細胞減少組和未發(fā)生白細胞減少組中，各基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。但以G/G基因型為參照，A/A基因型在0～Ⅱ度白細胞減少組中的頻率顯著低于Ⅲ/Ⅳ度白細胞減少組（OR校正=0.468，95%CI：0.204～0.711，P=0.008），提示攜帶A/A基因型患者在化療后發(fā)生中重度白細胞減少的風(fēng)險顯著高于攜帶G/G基因型患者，見表4。

圖1 各基因型患者的無進展生存曲線Fig.1 Progression-free survival curve of patients in each genotype group

表3 rs10759225位點多態(tài)性與化療后白細胞減少的關(guān)系［n（%）] Tab.3 Relationship between rs10759225 polymorphism and leukopenia［n（%）]

表4 rs10759225位點多態(tài)性與化療后白細胞減少程度的關(guān)系［n（%）] Tab.4 Relationshipbetween rs10759225polymorphism and degree of leukopenia［n（%）]

2.6.2 rs10759225位點多態(tài)性與中性粒細胞減少的關(guān)系 在發(fā)生中性粒細胞減少組和未發(fā)生中性粒細胞減少組中，各基因型的頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5。但以G/G基因型為參照，A等位基因型的頻率在0～Ⅱ度中性粒細胞減少組中顯著低于Ⅲ/Ⅳ度中性粒細胞減少組（OR校正=0.502，95%CI：0.155～0.887，P=0.022），提示攜帶A等位基因型患者在化療后發(fā)生中重度中性粒細胞減少的風(fēng)險較攜帶G/G基因型患者顯著增高，見表6。

表5 rs10759225位點多態(tài)性與化療后出現(xiàn)中性粒細胞減少的關(guān)系［n（%）] Tab.5 Relationship between rs10759225 polymorphism and neutropenia［n（%）]

表6 rs10759225位點多態(tài)性與化療后中性粒細胞減少程度的關(guān)系［n（%）] Tab.6 Relationship between rs10759225polymorphism and degree of neutropenia［n（%）]

2.6.3 rs10759225位點多態(tài)性與血小板減少的關(guān)系全組無患者出現(xiàn)Ⅳ度血小板減少。分析顯示，與攜帶G/G基因型患者比較，攜帶A等位基因型患者化療后發(fā)生血小板減少的風(fēng)險顯著增高（OR校正=0.494，95%CI：0.101～0.833，P=0.047），見表 7。

表 7 rs10759225位點多態(tài)性與化療后中性粒細胞減少的關(guān)系［n（%）] Tab.7 Relationship between rs10759225 polymorphism and neutropenia［n（%）]

2.6.4 rs10759225位點多態(tài)性與貧血的關(guān)系 全組無患者出現(xiàn)Ⅳ度貧血。各基因型的頻率在發(fā)生貧血組中與未發(fā)生貧血組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表8。但與攜帶G/G基因型患者比較，攜帶G/A基因型患者在化療后發(fā)生Ⅱ/Ⅲ度貧血的風(fēng)險顯著增高（OR校正=0.504，95%CI：0.213～0.890，P=0.047），見表9。

表8 rs10759225位點多態(tài)性與化療后貧血的關(guān)系［n（%）] Tab.8 Relationship between rs10759225 polymorphism and anemia［n（%）]

表9 rs10759225位點多態(tài)性與化療后貧血程度的關(guān)系［n（%）] Tab.9 Relationship between rs10759225 polymorphism and degree of anemia［n（%）]

3 討論

探索將DNA修復(fù)基因或其遺傳變異位點作為預(yù)測化療等治療手段療效和不良反應(yīng)的分子生物標(biāo)志物，以指導(dǎo)臨床實施精準(zhǔn)治療是NSCLC研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容［5，14-15]。RAD23B 基因定位于人類染色體9q31.2，是核苷酸切除修復(fù)通路修復(fù)順鉑等大分子引起DNA雙鏈損傷的關(guān)鍵因子［8]。當(dāng)DNA損傷發(fā)生后，RAD23B蛋白與著色性干皮病基因組C（XPC）蛋白結(jié)合形成的XPC-RAD23B復(fù)合體可最先結(jié)合到損傷部位，識別損傷片段和啟動修復(fù)過程［7，16-17]。RAD23B基因遺傳變異與腫瘤的相關(guān)研究已有報道，涉及的多態(tài)性位點包括rs1805329（又稱Ala249Val）和rs10739234等，其中有關(guān)rs1805329位點的研究最多，其他位點的研究少見。研究表明，rs1805329位點多態(tài)性與乳腺癌［9]、原發(fā)性肝癌［10]及非霍奇金淋巴瘤［11]的遺傳易感性有關(guān)，與攜帶TT基因型個體比較，攜帶CC基因型的個體罹患癌癥的風(fēng)險顯著增高。一項研究［18]在接受含DDP方案一線治療的NSCLC患者中，分析了rs1805329等位點多態(tài)性與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)攜帶rs1805329位點TT基因型患者的死亡風(fēng)險是攜帶CC基因型患者的2.08倍。但另一項在NSCLC患者中開展的相似研究（接受含鉑方案治療）卻未發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性與NSCLC患者的生存期有關(guān)［19]。一些研究還探討了rs1805329位點多態(tài)性與食管癌［20]、直腸癌［21]同期放化療引起的急性毒性反應(yīng)的關(guān)系，但均未發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)性。關(guān)于RAD23B基因的其他位點，僅檢索到一項研究報道了rs10739234位點多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)［9]。

本研究分析的rs10759225位點位于RAD23B基因的內(nèi)含子區(qū)，其多態(tài)性表現(xiàn)為腺嘌呤（A）被鳥嘌呤（G）替代。此位點發(fā)生突變對RAD23B功能的影響目前尚不明確，其與腫瘤的遺傳易感性、抗腫瘤治療的療效、不良反應(yīng)及患者預(yù)后等關(guān)系亦未見報道。本研究結(jié)果顯示，rs10759225位點多態(tài)性與含鉑類方案治療NSCLC的療效顯著相關(guān)，攜帶A等位基因型的患者治療有效（CR或PR）的概率顯著高于攜帶G/G基因型的患者。但未發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性與患者的PFS有關(guān)，可能原因為其他潛在的混雜因素影響了此位點的遺傳變異與患者預(yù)后的關(guān)系。而在RAD23B基因多態(tài)性與含鉑類方案治療NSCLC患者的預(yù)后關(guān)系方面，現(xiàn)有研究的報道結(jié)果也不一致［18-19]。因此，RAD23B基因的rs10759225等位點的遺傳變異對NSCLC患者生存期的影響尚待進一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，以G/G基因型為參照，含A等位（A/A和/或G/A）的基因型與含鉑類方案化療引起的血液學(xué)毒性密切相關(guān)。其中，A/A基因型與患者化療后發(fā)生Ⅲ/Ⅳ度白細胞減少的風(fēng)險相關(guān)，A等位基因型則與患者發(fā)生Ⅲ/Ⅳ度中性粒細胞減少和≥Ⅰ度血小板減少的風(fēng)險相關(guān)，而G/A基因型與發(fā)生Ⅱ/Ⅲ度貧血的風(fēng)險有關(guān)。為了消除潛在混淆因素對探討rs10759225位點多態(tài)性與相關(guān)指標(biāo)關(guān)系的影響，本研究在關(guān)聯(lián)分析中對性別、年齡、TNM分期和化療方案等多個因素進行了校正。結(jié)果表明，此位點可作為預(yù)測NSCLC患者對含鉑類方案的敏感性及發(fā)生骨髓抑制風(fēng)險的遺傳標(biāo)志物。由于rs10759225位點位于RAD23B基因的內(nèi)含子區(qū)，其發(fā)生的堿基突變并不影響基因編碼的mRNA和蛋白質(zhì)，因此該位點影響化療療效及相關(guān)血液學(xué)毒性的作用機制尚待進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RAD23B基因rs10759225位點多態(tài)性與含鉑類方案一線治療NSCLC的客觀緩解率及血液學(xué)毒性的發(fā)生風(fēng)險有關(guān)，此位點可能成為有效的療效預(yù)測指標(biāo)，為NSCLC患者的個體化治療提供依據(jù)。本研究入組的患者均在我院接受規(guī)范化診治，療效和不良反應(yīng)評估的一致性良好，但部分患者化療無效或出現(xiàn)疾病進展后，由于經(jīng)濟等原因終止后續(xù)治療，造成失訪率偏高，無法分析此位點的遺傳變異與患者總生存期的關(guān)系，有關(guān)方面有待進一步研究。