棉鈴蟲作為單核細胞增生李斯特菌感染模型的初步研究

楊麗玉， 劉嬋娟， 楊詩怡， 王菁妍， 羅 勤

(華中師范大學 生命科學學院 遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，以下簡稱Lm)是一種人畜共患的革蘭陽性致病菌，可以穿透人體的三大屏障—道屏障、血腦屏障和胎盤屏障[1]，造成人體感染，嚴重的可導致敗血癥、腦膜炎、流產，死亡率達20%～30%，曾被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為21世紀四大食源性致病菌之一[2-3]。因此，充分利用各種模型系統(tǒng)，深入研究Lm致病機制將為預防和治療李斯特菌病提供重要的理論和實踐基礎。Lm致病能力的高低與其毒力基因的表達調控密切相關，由prfA、hly、plcA、actA、mpl和plcB組成的Lm毒力基因島，在Lm發(fā)揮致病作用中起著至關重要的作用[1]。毒力基因島上基因的表達均直接或間接地受PrfA的調控。PrfA蛋白由prfA基因編碼，缺失prfA將會導致Lm致病能力的極大降低。PrfA屬于轉錄活化因子Crp/Fnr家族中的一員[4]。研究發(fā)現(xiàn)，當PrfA蛋白的第145位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸時就會導致該蛋白組成型表達(通常以PrfA*表示)。由于這種組成型表達蛋白不受環(huán)境因素變化的影響而一直處于高量表達狀態(tài)，導致攜帶有PrfA*菌株的毒力高于其他菌株[5]，因此PrfA*常被用作檢驗和比較李斯特菌對宿主致病能力的參照。近年來，由于昆蟲的操作便利性、培養(yǎng)的低成本以及道德上的可接受性等特點，特別是其雖只具有天然免疫系統(tǒng)，但與哺乳動物在進化上的保守性，利用適宜的昆蟲作為研究人類疾病致病機制的模型系統(tǒng)已被廣為接受。Mansfield等[6]在2003年已報道了利用黑腹果蠅作為探索Lm致病機制以及宿主對Lm免疫反應的模式生物；2010年Mukherjee等[7]發(fā)現(xiàn)不同毒力的Lm在侵染大蠟螟幼蟲后，可造成幼蟲不同程度的損傷和死亡。而且，大蠟螟可在37 ℃下生長和繁殖，此溫度條件對于模擬Lm侵染人體后毒力因子的表達是最為適宜的溫度[8-9]。盡管如此，大蠟螟作為研究人類病原菌致病機制的模型系統(tǒng)仍有一些不足。首先，大蠟螟全基因組序列尚未公布，這對于研究病原菌與宿主的互相作用存在較大的限制；其次，已報道的文獻中大多數(shù)是選擇大蠟螟幼蟲最后一個齡期注射病原菌，該齡期幼蟲蟲體一般長約20 mm，重約250 mg，大小適合人工注射和采集蟲體組織用于免疫組化等研究[7]，但最后一期幼蟲面臨變態(tài)成蛹，注射培養(yǎng)幾天后的病理反應往往受到變態(tài)反應的干擾，尤其是觀察幼蟲中腸細胞的形態(tài)時，遇到的問題最為突出。棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera(Hübner))廣泛分布在中國及世界各地，是棉花蕾鈴期重要的鉆蛀性害蟲[10]。棉鈴蟲和大蠟螟一樣，同屬于鱗翅目，但棉鈴蟲相較于大蠟螟，不僅各蟲態(tài)經歷的時間短(棉鈴蟲完成一個世代所需時間大約是大蠟螟的一半)，而且幼蟲形體較大。棉鈴蟲4齡幼蟲的長度(20～23 mm)和體重(180～230 mg)已達到大蠟螟幼蟲最后一個齡期的長度和體重，不但便于精準注射，而且易于收集蟲體內血淋巴、脂肪體和一些其他組織。同時，由于4齡棉鈴蟲不是最后一個齡期，在觀察蟲體中腸細胞的病理變化時，不容易受到變態(tài)反應的干擾，對病原菌的侵染也較為敏感。更為欣喜的是，棉鈴蟲的全基因組序列已在2017年公布[11]。但迄今為止，尚未有棉鈴蟲作為研究人類病原菌致病機制的模型系統(tǒng)的文獻報道。因此，本研究探索利用容易獲取、飼養(yǎng)方便且能在短時間內獲取結果的棉鈴蟲4齡幼蟲作為探究Lm致病機制的昆蟲模型，以期為進一步研究Lm與宿主的相互作用機制提供參考。本研究用Lm野生株(EGDe，中毒)和PrfA缺失株(EGDeΔprfA，弱毒)、以及PrfA組成型高表達株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*，高毒)注射棉鈴蟲4齡幼蟲，通過檢測不同毒力的Lm菌株對棉鈴蟲幼蟲的半數(shù)致死量、全蟲及體內不同部分(腸道、血淋巴、體液)的載菌量，觀察棉鈴蟲中腸病理變化，以及感染不同毒力的Lm對血細胞包囊作用和數(shù)目的影響，探究棉鈴蟲是否適合作為研究Lm致病機制的昆蟲模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和昆蟲 選用個體大小一致、生長發(fā)育同步的4齡棉鈴蟲幼蟲(購自河南科云生物科技有限公司)。在溫度(27±1) ℃，相對濕度(RH)65%～75%，光周期14 L∶10 D條件下飼養(yǎng)[12]。所用菌株EGDe和質粒pERL3為德國維爾茨堡大學Werner Gobel教授惠贈，EGDeΔprfA和EGDeΔprfA+pERL3-prfA*為本實驗室構建和保存。

1.1.2 主要試劑 BHI(Brain Heart Infusion，購自B&D 公司)；苦味酸混合固定液(購自湖北百奧斯生物科技有限公司)；Sephadex DEAE A-25色譜珠(購自Biosharp)；抗凝劑：NaCl(國藥)1.81 g、檸檬酸鈉(國藥)4.41 g、葡萄糖(Sigma)9.9 g、檸檬酸(國藥)2.73 g、EDTA(武漢飛揚生物)1.86 g，加入蒸餾水500 mL定容；李斯特菌顯色培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術有限公司)；引物由天一輝遠生物科技有限公司(武漢)合成。

1.1.3 儀器與設備 六孔板(6孔，購自無錫耐思生物科技有限公司)；人工氣候箱(HP300GS-C，購自武漢瑞華儀器設備有限責任公司)；倒置顯微鏡(COIC XDS-1B，購自重慶光電儀器有限公司)；微量進樣器(10 μL,購自上海高鴿工貿有限公司)；解剖鏡(SOPTOP，購自寧波舜宇儀器有限公司)；本研究病理切片由湖北百奧斯生物科技有限公司制作。

1.2 方法

1.2.1 不同毒力Lm生長曲線及生長形態(tài)的測定 將待測菌株過夜活化，次日按照1∶100轉接入新鮮的BHI培養(yǎng)基中，混勻后測定菌液在600 nm處的吸光度值(OD600)，記為0 h的值，180 r/min震蕩培養(yǎng)，每隔1 h檢測菌液OD600的變化，直到細菌生長至穩(wěn)定期。與此同時，在指定時期取0.1 mL菌液適當稀釋后涂布平板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后拍照并計數(shù)。以上實驗至少進行3次生物學重復。

1.2.2 棉鈴蟲半數(shù)致死量LD50的測定 選取生理狀態(tài)基本一致的4齡棉鈴蟲幼蟲置于冰上麻醉2 h待用。培養(yǎng)至108cfu/ml時，用BHI進行5倍梯度稀釋，稀釋為5個濃度(50、51、52、53、54倍)后，用微量進樣器分別吸取稀釋后的菌液5 μL，自棉鈴蟲第一腹足注入。每個濃度各注射18條棉鈴蟲，以注射5 μL BHI的棉鈴蟲為對照。注射后的棉鈴蟲幼蟲置于六孔板中，放入人工氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)飼養(yǎng)。分別在24、48和72 h統(tǒng)計棉鈴蟲幼蟲的死亡數(shù)量(幼蟲在觸摸時無任何反應時被認為已死亡)，計算死亡率，按照周一平[13]的方法，采用SPSS17.0軟件計算細菌對棉鈴蟲的半數(shù)致死量LD50。

1.2.3 棉鈴蟲中腸病理切片的制備和觀察 選取感染癥狀明顯的棉鈴蟲幼蟲，用無菌剪刀剪開第三頭足到第四腹足部分，取出中腸，用苦味酸混合固定液充分固定24 h后水洗。經過脫水、浸蠟、包埋一系列工序后，進行切片、展片、撈片、烤片和脫蠟，最后進行HE(蘇木精-伊紅染色法，Hematoxylin-Eosin staining)染色。所得病理切片置于倒置顯微鏡下觀察(10×和40×)，拍照記錄。

1.2.4 單核細胞增生李斯特菌對棉鈴蟲血細胞包囊作用的影響 參照Ling等[14]的方法進行體內包囊測定。Sephadex DEAE A-25色譜珠用作包囊目標。為了便于觀測珠子在蟲體的包囊程度，色譜珠事先用0.1%剛果紅染色2 h，UV光下干燥后，重懸于0.1 mol/L PBS溶液待用。生理狀態(tài)基本一致的4齡棉鈴蟲幼蟲經注射不同毒力的Lm或者BHI(如1.2.2所述處理)48 h后，從每組處理中選取18只幼蟲，并使用微量注射器將約30個珠子注射到每個幼蟲體腔中，12 h后解剖幼蟲，解剖鏡下觀察凝膠珠的包囊程度，拍照記錄。以上實驗至少進行3次生物學重復。

1.2.5 血細胞計數(shù) 分別對4齡棉鈴蟲幼蟲在感染Lm后的24、48和72 h時進行采血：剪去被感染棉鈴蟲幼蟲一對腹足，取血淋巴10 μL，加入90 μL抗凝劑混勻后，置于血球計數(shù)板，顯微鏡下觀察計數(shù)。每次隨機選取被感染棉鈴蟲3頭，重復3次取平均值，以注射BHI的棉鈴蟲為對照，方法相同。

1.2.6 棉鈴蟲全蟲及體內不同部分(腸道、血淋巴、體液)載菌量的測定 將感染Lm后的棉鈴蟲體表消毒后，無菌獲取棉鈴蟲全蟲或者體內不同部分(腸道、血淋巴、體液)，在裝有1 mL BHI的離心管中充分剪碎碾勻，用10 μm濾器過濾去除大的碎片和組織后，取10 μL濾液于李斯特菌顯色培養(yǎng)基進行平板涂布，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后計數(shù)統(tǒng)計。實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 單核細胞增生李斯特菌的生長曲線及菌落大小

為了保持細菌在注射棉鈴蟲時的初始濃度一致，對所用的3株Lm菌株(Lm野生株EGDe、PrfA缺失株EGDeΔprfA以及PrfA組成型高表達株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*))進行了生長曲線的測定。如圖1所示，在營養(yǎng)豐富的BHI培養(yǎng)基中，野生型EGDe生長最快，EGDeΔprfA次之，PrfA組成型高表達株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)最慢。為了準確比較這3株細菌的生長狀態(tài)，參照戴雄風等[15]的方法，檢測了EGDe、EGDeΔprfA以及EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的對數(shù)生長時期的倍增時間，分別為68、71和82 min，與生長曲線的結果相符。進一步比較3株菌在固體BHI平板上的菌落大小，發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)條件下PrfA組成型高表達菌株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)的菌落(平均直徑0.46 mm)明顯比野生株EGDe(0.788 mm)

圖1 不同毒力Lm在BHI中生長曲線的測定

和PrfA缺失株EGDeΔprfA(0.784 mm)的菌落小，且具有顯著性(P﹤0.05)。由此得出,當細菌在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長時，獨立于染色體外的多拷貝質粒pERL3以及所攜帶基因的高表達可能會影響細菌染色體基因的表達，從而影響細菌的生長速率和菌落大小。該結論與Klumpp等[16]在大腸埃希菌中表達多拷貝質粒pBR322以及外源R1蛋白的結果一致。

2.2 單核細胞增生李斯特菌對4齡棉鈴蟲幼蟲的致病能力

2.2.1 不同毒力單核細胞增生李斯特菌的半數(shù)致死量LD50及感染不同毒力單核細胞增生李斯特菌的棉鈴蟲的致死率 如表1所示，EGDe、EGDeΔprfA以及EGDeΔprfA+pERL3-prfA*對棉鈴蟲的LD50分別為2.56×103cfu/mL、1.98×106cfu/mL、6.63×102cfu/mL。與野生株EGDe相比，PrfA組成型高表達菌株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*有顯著性差異(P﹤0.05)，PrfA缺失株EGDeΔprfA有極顯著差異(P﹤0.01)。

圖2 棉鈴蟲在注射不同毒力Lm后不同時間段的死亡率

當注射細菌量為105cfu/mL的不同毒力的Lm后，如圖2所示，在24 h時觀察到感染了野生株EGDe的棉鈴蟲死亡率為50.01%，而感染了高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的棉鈴蟲的死亡率卻低于10%(僅為5.56%)，弱毒株EGDeΔprfA(注射量僅為LD50的5/6)幾乎不造成棉鈴蟲死亡；但在之后的24 h(即從注射時開始的24～48 h)內，高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*致幼蟲的死亡率急速上升，48 h時棉鈴蟲全部死亡；EGDe對幼蟲的死亡率趨于平緩，為94.4%，72 h致棉鈴蟲100%死亡，而弱毒株EGDeΔprfA在此時間內致棉鈴蟲死亡率幾乎為零。

表1 EGDe、EGDeΔprfA以及EGDeΔprfA+pERL3-prfA*對棉鈴蟲的半數(shù)致死量(LD50)

注：a、b分別表示與野生株(EGDe)相比，在同一時間內，其他菌株對棉鈴蟲半數(shù)致死量(LD50)的顯著差異性，a:P﹤0.05，b:P﹤0.01

2.2.2 感染單核細胞增生李斯特菌后，棉鈴蟲全蟲及體內不同部分(腸道、血淋巴、體液)的載菌量 4齡棉鈴蟲幼蟲經注射感染不同毒力的Lm后，分別在24 h和48 h選取相同數(shù)量的幼蟲，進行體表消毒，全蟲或者腸道、血淋巴、體液在BHI中充分剪碎碾勻，過濾除去大的碎片和組織，取適量濃度的濾液涂布Lm顯色鑒定平板，比較全蟲及體內不同部分(腸道、血淋巴、體液)細菌的數(shù)量。結果如圖3所示，不同毒力Lm注射感染棉鈴蟲后，24 h時，盡管同一菌株在棉鈴蟲體內的不同部位，如腸道、血淋巴和體液的載菌量無明顯差異，但不同菌株在棉鈴蟲同一組織的載菌量卻存在較大差別。其中，野生株EGDe的數(shù)量最高，達到了3.4×107cfu/mL(全蟲)，顯著高于其他菌株在體內的活菌數(shù)，而弱毒株EGDeΔprfA的數(shù)量最低，為3.36×103cfu/mL。該結果與注射細菌后棉鈴蟲在24 h的死亡率(圖2)相符。結合各個菌株的生長曲線(圖1)和對數(shù)期的倍增時間，對于野生株EGDe在感染24 h內表現(xiàn)出的較高毒力，認為由于野生株EGDe在蟲體內繁殖速度最快，從而相對于染色體上缺失了prfA的高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)，表達了更多的毒力蛋白。48 h時，野生株EGDe和高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)在棉鈴蟲體內各部分的載菌量均有所上升，其中體液中的載菌量增加最為明顯，其次為腸道；而EGDeΔprfA在棉鈴蟲各部分的載菌量卻隨時間推移不斷降低，48 h時，全蟲的載菌量僅為注射量的1/100左右，暗示了棉鈴蟲的天然免疫系統(tǒng)能夠較好地抵抗弱毒株EGDeΔprfA在體內的生長繁殖，而野生株EGDe及其高毒力突變株卻能成功突破棉鈴蟲的防御系統(tǒng)，在蟲體內生長繁殖，從而導致幼蟲死亡。

圖3 棉鈴蟲感染不同毒力Lm后全蟲及腸道、血淋巴和體液的載菌量

2.2.3 不同毒力單核細胞增生李斯特菌對棉鈴蟲中腸組織的致病性 4齡棉鈴蟲幼蟲經不同毒力Lm感染后，定時取中腸組織染色，制備病理切片。如圖4 A和B所示：注射BHI的空白對照組中腸腸壁形態(tài)完整，腸道上皮細胞(EC)排列緊密，圍食膜(PM)及微絨毛(AMP)清晰可見，上皮層與基底膜(BM)緊密接觸，這與南宮自艷等[17]的結果一致；注射24 h后，除PrfA缺失株EGDeΔprfA(弱毒)外，其余實驗組中腸柱狀細胞(GC)已開始伸長變成長橢圓形，圍食膜仍然存在，微絨毛開始出現(xiàn)斷裂脫落，注射了EGDe的棉鈴蟲腸道上皮細胞此時已開始出現(xiàn)溶解現(xiàn)象；注射48 h后(圖4 C、D)，各實驗組中腸局部細胞排列紊亂，出現(xiàn)空泡化及溶解現(xiàn)象，同時注射了高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)和中毒株(EGDe)的棉鈴蟲中腸細胞微絨毛斷裂脫落現(xiàn)象嚴重，而注射了弱毒株(EGDeΔprfA)的中腸細胞微絨毛清晰可見且較為完整。此外，發(fā)現(xiàn)此時感染了高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)的中腸細胞出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，所剩近乎單層細胞，而感染弱毒株(EGDeΔprfA)和中毒株(EGDe)的腸細胞無明顯脫落現(xiàn)象；注射72 h后(圖4 E、F)，除弱毒株外，其余實驗組的中腸細胞細胞核(NV)向腸腔擴散，此時感染了高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)的中腸細胞溶解脫落現(xiàn)象最為嚴重，細胞形態(tài)破壞殆盡，僅能見到殘存的圍食膜片段。以上結果顯示，Lm侵染棉鈴蟲幼蟲后，損害了棉鈴蟲中腸細胞的結構和形態(tài)，其受損程度與Lm毒力高低正相關。

圖4 棉鈴蟲中腸腸道病理切片

2.3 單核細胞增生李斯特菌對棉鈴蟲血細胞包囊作用和數(shù)量的影響

血細胞在昆蟲免疫應答中具有重要作用，活化的血細胞可對入侵的病原體進行吞噬、結節(jié)和包囊。小的病原體可直接被血細胞吞噬而殺滅，較大的病原體，首先被血細胞包圍，形成囊狀，然后進行黑化反應被清除。病原體引發(fā)的包囊作用取決于募集的血細胞數(shù)量和形成包囊的厚度。為了確定Lm感染棉鈴蟲后引起血細胞的防御反應和血細胞數(shù)量的波動情況，用Lm野生株及其突變株(EGDeΔprfA、EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)感染棉鈴蟲，并如上所述(方法1.2.4和1.2.5)感染后72 h內，檢測Lm對昆蟲血細胞的作用。

2.3.1 單核細胞增生李斯特菌對棉鈴蟲血細胞包囊作用的影響 棉鈴蟲在感染Lm 48 h時，微量注射Sephadex DEAE A-25色譜珠入體腔，12 h后，解剖幼蟲并在顯微鏡下觀察凝膠珠的包囊程度。如圖5所示,與注射BHI培養(yǎng)基的對照組相比，感染了弱毒株(EGDeΔprfA)的棉鈴蟲血細胞包裹凝膠珠的形態(tài)和厚度無明顯變化，而其他實驗組均有明顯的抑制血細胞包囊作用的現(xiàn)象，其中感染了高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)的凝膠珠外僅有少量血細胞包囊，而感染中毒株(EGDe)的血細胞包囊程度雖然有所減少，但遠不及高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)的減少程度。表明Lm能夠抑制棉鈴蟲血細胞的包囊作用，其抑制程度與細菌毒力正相關。

圖5 感染不同毒力Lm 48 h后棉鈴蟲血細胞對凝膠珠的包囊作用

2.3.2 棉鈴蟲血細胞數(shù)量變化 用不同毒力Lm感染棉鈴蟲后，分別于不同時間(24、48和72 h)進行血細胞計數(shù)。結果如圖6所示，相較于對照組，各實驗組在感染24 h后血細胞數(shù)量急劇上升，隨后不斷減少，在72 h后達到最低；且各實驗組72 h血細胞數(shù)量均顯著低于24 h。相比感染24 h時的血細胞數(shù)量，在72 h時，感染中毒株EGDe的棉鈴蟲血細胞數(shù)量減少45%，感染高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的棉鈴蟲血細胞數(shù)量減少71%，只有弱毒株(EGDeΔprfA)感染的棉鈴蟲保持了較高水平的血細胞數(shù)量，僅減少27%。由于棉鈴蟲的死亡與血細胞數(shù)量的破壞呈正相關[18]，因此實驗結果表明，Lm感染棉鈴蟲后，不僅導致棉鈴蟲血細胞數(shù)量減少，而且減少的程度與細菌的毒力高低呈正相關。

圖6 感染不同毒力Lm后棉鈴蟲血細胞數(shù)量變化

3 討 論

目前已經報道了利用多種模式宿主研究單核細胞增生李斯特菌的致病機制，如小鼠[19]、大蠟螟[7,20]、黑腹果蠅[6,21]和線蟲[22]等。每種宿主系統(tǒng)均有其操作的優(yōu)勢，同時也存在一定的限制。因此，不斷探索適合自身實際研究工作所需的模式系統(tǒng)是每位科學研究者的重要工作。

棉鈴蟲具有飼養(yǎng)方便、成本低廉、易于注射操作、實驗周期短等優(yōu)點，已作為模式昆蟲廣泛用于植物病蟲害防治的基礎研究，但迄今尚未有應用于人類病原菌研究的報道。本研究利用不同毒力的3株Lm菌注射感染4齡棉鈴蟲幼蟲，比較不同毒力Lm對棉鈴蟲的致病作用以及所引起的棉鈴蟲免疫反應。實驗結果顯示，不同毒力的Lm均能造成棉鈴蟲死亡。其中，高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*對棉鈴蟲的半數(shù)致死量LD50最低，弱毒株EGDeΔprfA的LD50最高，且菌株之間存在顯著差異。棉鈴蟲中腸病理切片結果也顯示，不同毒力的Lm均能造成棉鈴蟲中腸細胞的結構和形態(tài)發(fā)生病理改變，且其受損程度與Lm毒力高低正相關。雖然野生株EGDe在注射棉鈴蟲24 h內，造成蟲體死亡率顯著高于高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*和弱毒株EGDeΔprfA，但這種差異并不影響細菌對棉鈴蟲半數(shù)致死量的檢測。結合細菌在豐富培養(yǎng)基BHI中的菌落大小和生長速率結果，認為在棉鈴蟲感染的初期(24 h及以內)，由于多拷貝質粒的快速擴增耗費了大量ATP[17]，導致攜帶質粒的高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的生長受到抑制，而野生株EGDe不受質粒影響，在棉鈴蟲體內的繁殖速率較高，分泌出較多的毒性蛋白，從而導致更多的棉鈴蟲死亡。弱毒株EGDeΔprfA雖然也沒有多拷貝質粒，但由于細菌缺失了主要的毒力調控蛋白PrfA，分泌的毒力因子最少，因此造成棉鈴蟲的死亡率最低。與此類似，野生株EGDe感染棉鈴蟲24 h時，全蟲、腸、血淋巴及體液的載菌量同樣遠遠多于高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*，也可能是因為野生株EGDe較快速的生長繁殖造成的。同理，弱毒株EGDeΔprfA隨著感染時間的延長，在棉鈴蟲體內的活菌數(shù)逐漸減少，則可能是因為菌株的致病能力較弱，從而被激活的棉鈴蟲的免疫系統(tǒng)不斷清除而死亡，該結果與不同毒力的Lm對棉鈴蟲血細胞包囊作用的抑制以及血細胞數(shù)量的影響相符，表明Lm能在棉鈴蟲體內生長繁殖、分泌毒性蛋白、激活棉鈴蟲的免疫系統(tǒng)產生免疫反應，最終被清除或者導致棉鈴蟲免疫系統(tǒng)崩潰死亡。Lm對棉鈴蟲幼蟲的致病能力強弱與菌株毒力高低正相關。因此，我們認為棉鈴蟲幼蟲(至少是4齡棉鈴蟲幼蟲)適合作為研究Lm致病機制的宿主模型，且可進一步用于探究天然免疫系統(tǒng)抵御病原菌入侵的機理以及病原菌與宿主的相互作用的基礎研究中。盡管如此，該模型仍存在一些限制，主要表現(xiàn)在棉鈴蟲這種鱗翅目昆蟲并不具有像哺乳動物那樣完善的獲得性免疫防御系統(tǒng)，且其最適溫度是28 ℃，而人類病原菌適合在37 ℃下生長，這可能影響某些基因的表達。因此，在運用模型系統(tǒng)研究病原菌的致病機制時，需要考慮這些因素的影響，謹慎分析實驗結果。