基于可培養(yǎng)法分析新疆葡萄與葡萄酒相關(guān)酵母菌菌群結(jié)構(gòu)

王冠群， 楊創(chuàng)舉， 朱麗霞*

(1.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)

新疆所處地理位置深居內(nèi)陸，遠(yuǎn)離海洋，具有獨(dú)特的大陸性氣候，因其地理特殊、氣溫高、降水少、日照時(shí)間長(zhǎng)等環(huán)境特點(diǎn)使新疆成為優(yōu)質(zhì)葡萄栽培地和葡萄酒的釀造地，新疆的葡萄主產(chǎn)區(qū)幾乎與法國(guó)的優(yōu)質(zhì)葡萄產(chǎn)區(qū)處于同一緯度[1]。新疆得天獨(dú)厚的氣候與資源優(yōu)勢(shì)造就了微生物及酵母菌資源的多樣性、獨(dú)特性和復(fù)雜性。新疆具有種植優(yōu)良的葡萄、優(yōu)質(zhì)的釀酒酵母及釀制優(yōu)良葡萄酒的風(fēng)土條件。由于具有悠久的釀造歷史，新疆各大葡萄產(chǎn)區(qū)和釀酒基地形成了一個(gè)獨(dú)特且穩(wěn)定的微生物環(huán)境，具有大量適應(yīng)本土釀造葡萄酒的酵母菌，極具研究?jī)r(jià)值。新疆天山北麓與法國(guó)波爾多、美國(guó)加州那帕山谷同處在北緯44°，陽光充足，土地貧瘠，水質(zhì)純凈，土壤富含鉀、鈣等礦物質(zhì)，為葡萄的種植提供了優(yōu)良的自然條件[2]。目前，專家學(xué)者對(duì)新疆葡萄酒相關(guān)酵母的研究主要集中在瑪納斯、石河子、吐魯番、鄯善等地，發(fā)現(xiàn)葡萄酒相關(guān)酵母菌具有豐富的多樣性。本研究通過對(duì)全疆各地采樣并分離鑒定，期望對(duì)新疆酵母菌多樣性做出較為全面的分析，這對(duì)新疆葡萄酒酵母資源研究具有一定的理論和實(shí)際意義。傳統(tǒng)的釀酒酵母分類鑒定主要根據(jù)酵母菌形態(tài)學(xué)特征以及生理生化試驗(yàn)特征，再參照相關(guān)鑒定手冊(cè)，才能進(jìn)行相關(guān)菌種的鑒定。傳統(tǒng)鑒定工作量大、周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜且鑒定結(jié)果的重復(fù)性差[3]。使用WL培養(yǎng)基鑒別酵母菌，是一種相對(duì)傳統(tǒng)的常規(guī)鑒定方法而言較為快速的常用鑒定方法[4]。酵母菌在WL培養(yǎng)基上培養(yǎng)后會(huì)根據(jù)其所呈現(xiàn)不同的菌落形態(tài)和顏色，來區(qū)分不同的酵母菌，因此WL培養(yǎng)基也可以用于分類鑒定常見的葡萄酒相關(guān)酵母菌[5]，分類結(jié)果較為準(zhǔn)確。隨著對(duì)酵母基因組的不斷認(rèn)識(shí)和深入，現(xiàn)代分子學(xué)鑒定方法已經(jīng)成為快速準(zhǔn)確的分類鑒定方法，26S rDNA D1/D2、5.8S-ITS 等序列分析方法在酵母菌的種間鑒定方面具有很大的優(yōu)勢(shì)[6-7]?，F(xiàn)代分子學(xué)鑒定方法具有穩(wěn)定性好、便于操作、快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。將酵母菌的表型特征與基因型特征結(jié)合起來對(duì)分離葡萄酒酵母菌進(jìn)行鑒定，對(duì)分析其多樣性具有重要的意義，同時(shí)也有利于深入準(zhǔn)確地了解酵母菌種資源在新疆各產(chǎn)區(qū)的分布。本研究利用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)新疆地區(qū)的葡萄酒相關(guān)酵母進(jìn)行了初步分類，并對(duì)代表菌進(jìn)行了分子鑒定，研究了表型多樣性與種群多樣性，旨在探明新疆葡萄酒相關(guān)酵母菌的分布規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 菌株分離自新疆沿天山北帶、伊犁河谷地區(qū)、吐魯番地區(qū)、環(huán)塔里木盆地地區(qū)的葡萄種植區(qū)及釀酒地。從隸屬于新北疆的60個(gè)縣市、建設(shè)兵團(tuán)13個(gè)師所采集的565份葡萄、104份土樣、33份葡萄酒廠樣品中分離得到的3 991株新疆本土葡萄酒酵母菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基[8]：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，蒸餾水配制，自然 pH 值，121 ℃高壓滅菌20 min；WL培養(yǎng)基：商用培養(yǎng)基80 g/L，經(jīng)加熱煮沸至完全溶解，分裝后115 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑 酵母膏、蛋白胨、葡萄糖(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)； WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，5.8S-ITS引物 ITS1 /ITS4、26S rDNA D1/D2引物 NL1/NL4(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌WL培養(yǎng)基表型分類 經(jīng)活化(吸取經(jīng)25%甘油保藏的菌液于裝有1 mL滅菌的YPD培養(yǎng)基中，接種量為5%，(28±1) ℃恒溫培養(yǎng)24 h)后的菌株，在WL培養(yǎng)基上劃線接種，28 ℃培養(yǎng)3～8 d，觀察并記錄菌落大小及形態(tài)，包括質(zhì)地、顏色、表面特征、側(cè)面特征、邊緣特征等，進(jìn)行分析和初步歸類。

1.2.2 酵母菌分子鑒定 DNA的提取采用凍融法[9]，5.8S-ITS區(qū)和26S rDNA D1/D2 PCR擴(kuò)增條件及系統(tǒng)發(fā)育分析參照文獻(xiàn)[10]，將PCR 產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用BLAST進(jìn)行相關(guān)序列搜索，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有的近緣菌株進(jìn)行序列比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌WL表型特征觀察及初步聚類分析

根據(jù)酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及顏色，將3 991株葡萄酒酵母菌分為22類WL表型，通過WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基菌落表型觀察與Cavazza等[12]的描述10對(duì)比分析(表1)，其中WL3、6、11、12確定為畢赤屬酵母(Pichia)，表型WL8、16為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，WL18為紅酵母(Rhodutorula)，WL5、15為克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)，WL4為梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)，WL9為膜璞畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)，WL10、13、14、17、19為葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporaopuntiae)，WL1、2、7、20、21、22在文獻(xiàn)中未提及。

表1 WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)類型及其描述

表2 新疆葡萄酒相關(guān)酵母各WL類型菌株數(shù)統(tǒng)計(jì)表

由表2可知，新疆全疆各地分離出的葡萄酒相關(guān)酵母，WL8為2 458株(占總菌株的61.59%)，WL2為356株(占總菌數(shù)的8.92%)，多于100株的WL表型為WL1、WL3、WL4、WL5、WL19。

3 991株葡萄酒相關(guān)酵母的WL表型進(jìn)行分布矩陣(圖1)，由圖1可知，WL1、2、3、8、19表型廣泛存在于新疆各地區(qū)和酒廠內(nèi)，其中WL8存在于新疆所有地區(qū)及酒廠內(nèi)。昌吉和伊犁地區(qū)酵母菌菌落形態(tài)最多，達(dá)18種；葉城地區(qū)和中信國(guó)安酒廠、鄉(xiāng)都酒業(yè)、野果林的菌落形態(tài)最少，僅有1種，均為WL8。

2.2 分子系統(tǒng)學(xué)分析和分類

從葡萄酒相關(guān)樣品中分離出的3 991株酵母菌中，挑選出22株不同WL表型代表菌株進(jìn)行分子鑒定。

圖1 酵母菌不同WL菌落表型在新疆各地區(qū)分布矩陣圖

The black notes that there is the yeast species in the area,otherwise the white notes that there is no the yeast species in the area,figure 4 same

2.2.1 序列分析結(jié)果 對(duì)22株不同表型代表菌株的5.8S-ITS區(qū)和26S rDNA D1/D2區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定分析(圖2、3)，5.8S-ITS區(qū)和26S rDNA D1/D2區(qū)共同鑒定出WL1、2 的酵母菌為仙人掌有孢漢遜酵母(Hanseniasporaopuntige)；WL3、7為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，WL4為美極梅奇酵母(M.pulcherrima)；WL18為核果梅奇酵母 (Metschnikwoiafructicola)；WL20為韓國(guó)梅奇酵母(Metschnikwoiakoreensis)；WL5、15為克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)；WL6、9、12為庫(kù)德畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)；WL11為陸生畢赤酵母(Pichiaterricola)；WL13、14、17、19為葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporaurarum)；WL8、16 釀酒酵母(S.cerevisiae)；WL22為星狀假絲酵母(Starmerellabacillaris)。WL 21通過5.8S-ITS區(qū)鑒定為伊薩陸生酵母 (Issatchenkiaterricola)；WL 10通過26S rDNA D1/D2為Methnikowiaaff。

22株代表菌中有2株仙人掌有孢漢遜酵母；2株異常威克漢姆酵母，1株美極梅奇酵母；1株核果梅奇酵母；1株韓國(guó)梅奇酵母；2株克魯維畢赤酵母；3株庫(kù)德畢赤酵母；1株陸生畢赤酵母；4株葡萄汁有孢漢遜酵母；2株釀酒酵母；1株伊薩陸生酵母；1株星狀假絲酵母，共計(jì)7個(gè)屬13個(gè)種(見圖2、3)。

圖2 基于5.8S-ITS rDNA區(qū)域序列和NJ法不同表型酵母菌和相關(guān)酵母模式菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于26S rDNA D1/D2區(qū)域序列和NJ法不同表型酵母菌和相關(guān)酵母模式菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.2 新疆各地區(qū)菌種分布分析 綜合比較分析5.8S-ITS rDNA區(qū)及26S rDNA D1/D2區(qū)測(cè)序結(jié)果，22個(gè)WL類型共屬于7個(gè)屬13個(gè)種，分別為仙人掌有孢漢遜酵母、異常威克漢姆酵母、克魯維畢赤酵母、庫(kù)德畢赤酵母、陸生畢赤酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母、釀酒酵母、美極梅奇酵母、Metschnikowiaaff、核果梅奇酵母、韓國(guó)梅奇酵母、伊薩陸生酵母、星狀假絲酵母。由表4可知，全疆3 991株葡萄酒相關(guān)酵母菌中有2 476株屬于釀酒酵母,占總菌數(shù)的62%；Metschnikowiaaff、伊薩陸生酵母、星狀假絲酵母菌數(shù)最少,分別為4株、4株、3株。仙人掌有孢漢遜酵母在非釀酒酵母菌中所占比例最高為64.24%。因此，新疆地區(qū)優(yōu)勢(shì)種屬為釀酒酵母和非釀酒酵母仙人掌有孢漢遜酵母。

表4 新疆葡萄酒相關(guān)酵母菌所屬種屬菌株數(shù)統(tǒng)計(jì)表

圖4 酵母菌不同種屬在新疆各地區(qū)分布矩陣圖

對(duì)新疆葡萄酒相關(guān)酵母7個(gè)屬13個(gè)種進(jìn)行采樣，各地區(qū)分布矩陣分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，仙人掌有孢漢遜酵母、異常威克漢姆酵母、釀酒酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母廣泛存在于新疆各地區(qū)，其中釀酒酵母存在于新疆所有采樣地區(qū)。伊犁和于田地區(qū)酵母菌種類最多，達(dá)10個(gè)種；葉城地區(qū)和中信國(guó)安酒廠、鄉(xiāng)都酒業(yè)、野果林酵母菌種類最少，僅有1種，為釀酒酵母。

3 討 論

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的在葡萄漿果上、葡萄汁和葡萄酒中分布的酵母菌有約20個(gè)屬的百余種[13]。目前，對(duì)已報(bào)道的文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，我國(guó)新疆葡萄酒酵母資源已發(fā)現(xiàn)的共約20個(gè)屬的53個(gè)種，統(tǒng)計(jì)情況見表5，其中星狀假絲酵母(C.zemplinina)，又稱S.bacillaris[14]；異常畢赤酵母(P.anomala)，又稱異常威克漢姆酵母(W.anomala或H.anomala)[14]。由表5可見，新疆分布較為廣泛的優(yōu)勢(shì)屬是有孢漢遜酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、伊薩酵母屬、梅奇酵母屬、酵母屬，酵母菌種數(shù)最多的屬是假絲酵母屬，有11種。分布最廣泛的菌種是常見的葡萄汁有孢漢遜酵母、季也蒙有孢漢遜酵母、克魯維畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母、東方伊薩酵母(現(xiàn)更名為P.kudriazvii[15])、美極梅奇酵母、釀酒酵母。本研究發(fā)現(xiàn)的7個(gè)屬13個(gè)種的葡萄酒相關(guān)酵母菌中，有6個(gè)屬7個(gè)種為新疆常見及分布較為廣泛的酵母菌。有4個(gè)種(陸生畢赤酵母、Metschnikowiaaff、核果梅奇酵母、韓國(guó)梅奇酵母)在新疆地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)，值得進(jìn)一步研究和開發(fā)。表明新疆地區(qū)葡萄酒相關(guān)酵母菌具有豐富的多樣性和極大的發(fā)掘潛力。本研究對(duì)新疆本土葡萄酒相關(guān)酵母菌的種群分布特征進(jìn)行了初步探究，為生產(chǎn)具有本土特色的葡萄酒提供菌種資源，但對(duì)于新疆各產(chǎn)區(qū)酵母菌的釀造特性以及利用價(jià)值還需要進(jìn)一步的探討與研究。近幾年，雖然許多學(xué)者利用WL培養(yǎng)基鑒定葡萄酒酵母菌作為常用輔助手段，但是WL培養(yǎng)基的鑒定方法目前僅限于歐亞種基礎(chǔ)上的鑒定，現(xiàn)僅有13類鑒別指標(biāo)作為酵母菌分類的依據(jù)[12]，對(duì)于有些酵母菌尚不能精確到種，鑒定存在一定局限性，故今后的研究中還需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證及完善補(bǔ)充。目前用于新疆酵母菌分類鑒定的培養(yǎng)基比較單一，對(duì)代表菌株進(jìn)行分子鑒定，是一次性酵母菌鑒定出種類較少的原因。隨著測(cè)序成本的降低，可利用高通量測(cè)序分析新疆葡萄與葡萄酒相關(guān)的酵母菌的多樣性及菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)合可培養(yǎng)方法，利用多種分離培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)等方法進(jìn)行分類鑒定，進(jìn)一步豐富菌株種類，為建立酵母菌庫(kù)提供參考。

表5 新疆葡萄酒相關(guān)酵母菌

續(xù)表5

注： A：YPD表型，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)，26S rDNA序列；B：WL表型、ITS-5.8S序列；C：WL表型，26S rDNA序列； D：YPD表型，26S rDNA序列

本研究對(duì)新疆境內(nèi)60個(gè)縣市、建設(shè)兵團(tuán)13個(gè)師的565份葡萄、104份土樣、33份葡萄酒廠樣品中的3 991株新疆本土葡萄酒酵母菌進(jìn)行了分類鑒定和多樣性分析。通過WL培養(yǎng)基表型分類共分為22類，其中，WL1、2、3、8、19類型廣泛存在于新疆各地區(qū)和酒廠內(nèi)，WL 8存在于新疆所有地區(qū)及酒廠內(nèi)。昌吉和伊犁地區(qū)酵母菌菌落形態(tài)最多，達(dá)18種；葉城地區(qū)和中信國(guó)安酒廠、鄉(xiāng)都酒業(yè)、野果林的菌落形態(tài)最少，僅有1種，均為WL8。

經(jīng)分子鑒定所有菌株隸屬7個(gè)屬13個(gè)種。其中WL1、2為仙人掌有孢漢遜酵母，WL3、7為異常威克漢姆酵母，WL5、15為克魯維畢赤酵母，WL6、9、12為庫(kù)德畢赤酵母，WL11為陸生畢赤酵母，WL13、14、17、19為葡萄汁有孢漢遜酵母，WL8、16為釀酒酵母，WL4為美極梅奇酵母，WL10為Metschnikowiaaff，WL18為核果梅奇酵母，WL20為韓國(guó)梅奇酵母，WL21為伊薩陸生酵母，WL22為星狀假絲酵母。仙人掌有孢漢遜酵母為非釀酒酵母中的優(yōu)勢(shì)種。伊犁和于田地區(qū)酵母菌種類最多，達(dá)10個(gè)種；葉城地區(qū)和中信國(guó)安酒廠、鄉(xiāng)都酒業(yè)、野果林等酵母菌種類最少，僅有1種，為釀酒酵母。優(yōu)勢(shì)種為仙人掌有孢漢遜酵母、釀酒酵母。