Viperin抑制黃病毒屬感染作用機(jī)制研究進(jìn)展

許淑娟， 謝晶瑩， 馮若飛*

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

抗病毒免疫因子(Virus inhibitory protein，endoplasmic reticulum-associated，interferon-inducible，Viperin)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有重要免疫活性的宿主蛋白。Zhu等[1]在研究人巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus，HCMV)感染人原代成纖維細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)2個(gè)轉(zhuǎn)錄增高的基因片段，分別命名為cig5和cig33。之后，Chin等[2-3]從HCMV感染的細(xì)胞中克隆了一段cDNA序列，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)這段cDNA與cig5和cig33的融合序列高度相似，將其命名為Viperin。人類(lèi)Viperin蛋白由361個(gè)氨基酸編碼，分子質(zhì)量約為42 kD。在目前已知的物種中，Viperin蛋白有3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：易突變的氨基端結(jié)構(gòu)域、高度保守的SAM結(jié)構(gòu)域(S-adenosyl methionine，SAM)和羧基端結(jié)構(gòu)域。氨基端結(jié)構(gòu)域包含的兩親性α螺旋具有介導(dǎo)Viperin定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和脂筏上的功能[4]。SAM結(jié)構(gòu)域包含4個(gè)保守的模序，其中模序1(M1)包含3個(gè)半脫氨酸殘基CxxxCxxC基序，該基序參與[4Fe-4S]簇的形成[5-6]。羧基端結(jié)構(gòu)域可能參與蛋白和蛋白相互作用或介導(dǎo)酶活性的底物識(shí)別。Viperin抵抗病毒感染時(shí)，會(huì)因?yàn)椴《镜念?lèi)型不同而發(fā)揮不同功能域的作用?；驁D譜微陣列研究表明，Viperin基因是最容易誘導(dǎo)的干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)之一[7]。在正常情況下，該蛋白在細(xì)胞中表達(dá)水平較低，受到干擾素(IFN)、雙鏈 DNA、雙鏈 RNA 類(lèi)似物(Poly I：C)、脂多糖(Lipopoly saccharide，LPS)及多種病毒誘導(dǎo)后表達(dá)水平會(huì)上升。近年來(lái)，在Viperin的抗病毒研究中發(fā)現(xiàn)，Viperin不僅能夠與某些病毒蛋白發(fā)生相互作用，抑制病毒增殖，而且能夠與細(xì)胞內(nèi)脂筏形成的相關(guān)蛋白進(jìn)行相互作用，阻止病毒出芽，達(dá)到抗病毒效果[8]。黃病毒是一類(lèi)通過(guò)節(jié)肢動(dòng)物傳播的病毒，每年有數(shù)百萬(wàn)人感染黃病毒。多數(shù)黃病毒屬于嗜神經(jīng)病毒，它們會(huì)引起嚴(yán)重的腦炎，甚至死亡。目前研究發(fā)現(xiàn)黃病毒屬病毒擁有7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)和3種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C、包膜蛋白E和膜蛋白prM/M)[9-11]。通過(guò)IFN誘導(dǎo)表達(dá)的Viperin蛋白可以抑制多數(shù)黃病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，包括登革熱病毒(Dengue virus，DENV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)、西尼羅病毒(West nile virus，WNV)和Langat病毒(Langat virus，LGTV)等。本文就Viperin抗上述幾種黃病毒的作用機(jī)制綜述如下。

1 Viperin對(duì)登革熱病毒(DENV)感染的影響

登革熱病毒(Dengue virus，DENV)為小顆粒(直徑40～60 nm)單股正鏈RNA病毒[12]。近幾年有報(bào)道稱(chēng)，Viperin是DENV感染細(xì)胞中高度誘導(dǎo)的ISGs之一[13]，發(fā)現(xiàn)它與DENV-2衣殼(CA)、NS3和病毒RNA共定位并相互作用，并且發(fā)現(xiàn)這種相互作用與它的抗病毒活性有關(guān)[14-15]。在DENV-2感染細(xì)胞中，Viperin不影響DENV-2進(jìn)入細(xì)胞，但會(huì)抑制DENV-2 RNA的復(fù)制和病毒粒子的釋放。NS3(69 kD)是DENV病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的重要蛋白[16]。Viperin的抗DENV感染特性是由它的羧基端與DENV-2的 NS3蛋白相互作用，通過(guò)干擾DENV-2復(fù)制復(fù)合物合成減少早期RNA的產(chǎn)生[17]。脂筏在許多病毒的包裝、出芽和侵入過(guò)程中參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的整合和胞內(nèi)膜運(yùn)輸?shù)亩ㄏ蚝头诌x[18]，Viperin可以通過(guò)抑制病毒粒子和脂筏之間的作用來(lái)抑制病毒復(fù)制，據(jù)報(bào)道，在DENV-2感染細(xì)胞中，Viperin與脂筏標(biāo)記物BODIPY共定位，說(shuō)明Viperin可以通過(guò)阻止CA與脂筏的結(jié)合來(lái)減少DENV的RNA復(fù)制和病毒粒子的產(chǎn)生[19]。

2 Viperin對(duì)寨卡病毒(ZIKV)感染的作用

寨卡病毒是一種由伊蚊傳播的單股正鏈RNA病毒，病毒顆粒呈圓球狀, 直徑約40～70 nm (也有報(bào)道其直徑僅約20 nm) , 具有囊膜, 表面有棘突[20]。在Vanwalscappel等[21]的研究中，正常情況下ZIKV無(wú)法感染巨噬細(xì)胞，但將巨噬細(xì)胞中Viperin基因敲除后，ZIKV則可以感染巨噬細(xì)胞，說(shuō)明Viperin能夠阻斷ZIKV感染宿主細(xì)胞。Viperin阻斷ZIKV感染的機(jī)制是在ZIKV進(jìn)入細(xì)胞后，抑制了病毒早期RNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成，從而抑制了病毒的增殖。最近的研究證實(shí)Viperin可以通過(guò)誘導(dǎo)ZIKV中NS3蛋白降解干擾病毒早期RNA合成[22]。此外，Viperin還通過(guò)和NS3的相互作用降低了ZIKV中其他幾種蛋白的穩(wěn)定性，從而抑制ZIKV的復(fù)制。為了確定Viperin對(duì)ZIKV的抗病毒活性區(qū)域，在對(duì)HCV和DENV研究中改造的Viperin蛋白的基礎(chǔ)上[14，23]，對(duì)Viperin基因進(jìn)行改造，形成4種突變CHME3小膠質(zhì)細(xì)胞系，其中有兩種突變細(xì)胞系是對(duì)Viperin基因的羧基端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行缺失改造[21]。在ZIKV對(duì)這上述4種突變細(xì)胞系感染24 h后，發(fā)現(xiàn)ZIKV對(duì)兩種羧基端結(jié)構(gòu)域突變細(xì)胞系的感染能力比另外兩種細(xì)胞系強(qiáng)，說(shuō)明羧基端結(jié)構(gòu)域是Viperin對(duì)ZIKV的重要抗病毒活性區(qū)域。

3 Viperin對(duì)蜱傳腦炎病毒(TBEV)的影響

蜱傳腦炎病毒是一種經(jīng)硬蜱傳播的球狀病毒，直徑40～50 nm, 有囊膜, 囊膜表面可見(jiàn)棘突[24]，主要侵染人中樞神經(jīng)系統(tǒng)。蜱傳腦炎 TBEV對(duì)Viperin高度敏感，因此作為研究Viperin的模型病毒。研究顯示Viperin能夠與TBEV的結(jié)構(gòu)蛋白prM和E以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS2A、NS2B、NS3相互作用且共定位[22]。TBEV的NS3蛋白是一種具有NTPase活性和絲氨酸蛋白酶活性的多功能蛋白，對(duì)TBEV的復(fù)制具有重要作用。在NS3存在的情況下，Viperin和NS3的相互作用致使NS3蛋白酶降解，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)蛋白prM和E以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS2A和NS2B也被降解。這說(shuō)明，Viperin能特異性降解TBEV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3及其輔助因子，并由此限制TBEV在細(xì)胞中病毒蛋白質(zhì)的合成來(lái)抑制其復(fù)制。值得注意的是，外源性添加TBEV或ZIKV編碼NS3的質(zhì)?？上齎iperin的抗病毒作用。這恰好再一次證明NS3蛋白對(duì)于TBEV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的重要性。同樣也說(shuō)明了NS3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量超過(guò)Viperin在體內(nèi)的積累量時(shí)，Viperin就無(wú)法阻止TBEV或ZIKV在細(xì)胞體內(nèi)的復(fù)制。與ZIKV不同，Viperin對(duì)TBEV的抗病毒活性需要SAM結(jié)構(gòu)域[25]，Upadhyay曾研究過(guò)SAM結(jié)構(gòu)域在TBEV的抗病毒活性中的重要性，Upadhyay將SAM結(jié)構(gòu)域中的4個(gè)保守SAM模序全部單獨(dú)點(diǎn)突變，構(gòu)成4種突變體質(zhì)粒(突變體為M1～M4)，將這4種突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后感染TBEV，觀察TEBV的復(fù)制。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染這4種質(zhì)粒的Hela細(xì)胞中Viperin雖然在蛋白水平均可檢測(cè)到，但卻都失去了抑制TBEV復(fù)制的作用[26]。這表明Viperin的SAM結(jié)構(gòu)域?qū)BEV的抗病毒功能需要全部4個(gè)SAM域模序。

4 Viperin對(duì)其他病毒的抑制作用

目前僅有Viperin在體內(nèi)針對(duì)2種黃病毒的體內(nèi)研究，這2種黃病毒分別為西尼羅病毒和Langat病毒。在這2種病毒感染小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，Viperin可以促進(jìn)LGTV和WNV感染小鼠血清中IFN I的產(chǎn)生[22]。在Szretter等[27]的研究中，敲除Viperin基因，小鼠的脾臟、腎臟和大腦表現(xiàn)為WNV感染率增加，因而出現(xiàn)更高的死亡率。接種弱毒型的LGTV時(shí)，野生型(WT)小鼠與Viperin-/-小鼠經(jīng)腹腔感染后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示它可以抑制脾臟、大腦中的LGTV復(fù)制，卻不能抑制小腦或腦干中的LGTV復(fù)制[28]。在沒(méi)有Viperin的情況下，小鼠感染W(wǎng)NV后，Viperin-/-小鼠大腦皮層和白質(zhì)區(qū)的WNV復(fù)制水平較高。有文章報(bào)道稱(chēng)，Viperin在皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞中本底表達(dá)水平較高，并且在病毒感染后迅速上調(diào)[29]。但在使用IFN處理Viperin-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞后，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)與其他的ISG的表達(dá)量比較，只激活了少量Viperin表達(dá)。從小鼠大腦中分離出來(lái)的皮層神經(jīng)元，在IFN處理后，Viperin高表達(dá)并抑制了LGTV、TBEV、WNV、ZIKV復(fù)制。相反，從小鼠小腦中分離出的神經(jīng)元顆粒細(xì)胞在IFN處理后并不依賴(lài)Viperin產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)。結(jié)合這些數(shù)據(jù)，說(shuō)明Viperin介導(dǎo)了腦內(nèi)LGTV、TBEV、WNV的細(xì)胞類(lèi)型和區(qū)域特異性抑制。

5 展 望

黃病毒嚴(yán)格依賴(lài)細(xì)胞分泌途徑，這種途徑將蛋白質(zhì)和胞膜成分從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)高爾基體傳遞到細(xì)胞質(zhì)膜，用于病毒粒子的組裝、成熟和釋放[30]。Viperin正是通過(guò)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及脂筏來(lái)抑制黃病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制、蛋白合成、釋放等過(guò)程。Viperin可以與日本乙型腦炎(Epidemic Encephalitis B，JEV)、TBEV和ZIKV等黃病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3相互作用來(lái)抑制病毒RNA的積累，NS3和Viperin之間的這種相互作用在黃病毒中相當(dāng)普遍。雖然NS3與Viperin相互作用和共定位，但是只有TBEV和ZIKV的NS3被降解，這說(shuō)明Viperin對(duì)這些病毒的抗病毒活性與降低NS3穩(wěn)定性的能力密切相關(guān)但降解NS3蛋白是特異性的[25]。除黃病毒屬外，還發(fā)現(xiàn)HCV感染的細(xì)胞中，Viperin能在病毒復(fù)制復(fù)合體的脂滴表面與HCV 的NS5A結(jié)合。同樣也發(fā)現(xiàn)Viperin能與原病毒宿主因子vapa相互作用，損害vapa與NS5A的關(guān)聯(lián)[31]。因此，不同黃病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白與Viperin的結(jié)合位點(diǎn)保守的特性可作為一個(gè)很好的研究切入點(diǎn)，為黃病毒感染導(dǎo)致的相關(guān)疾病提供一種潛在有效的治療策略。

近年來(lái)，有關(guān)Viperin抗病毒活性的研究成為一大熱點(diǎn)，并取得了很多新的進(jìn)展。目前研究較多的是Viperin在不同的物種中，不同的病毒感染后所表現(xiàn)的抗病毒活性。除了抗病毒作用外，Viperin還參與巨噬細(xì)胞的分化。在近期的報(bào)道中提到，Viperin缺乏可促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)M1和M2細(xì)胞因子的分泌[32]。隨著對(duì)Viperin抗病毒作用研究的深入，發(fā)現(xiàn)Viperin可以在病毒生命周期的不同階段抑制不同的病毒，且有多種途徑誘導(dǎo)Viperin表達(dá)，表明該蛋白具多種功能。針對(duì)該蛋白的一些抗病毒作用的分子機(jī)制逐漸有些進(jìn)展[33]，希望以其有效的廣譜抗病毒活性為切入點(diǎn)，研發(fā)針對(duì)多種病毒的多價(jià)疫苗，為特異性免疫治療手段提供理論基礎(chǔ)。除此之外，它還具備哪些生物學(xué)功能，這些功能對(duì)不同的細(xì)胞、病毒還具有什么作用，這些問(wèn)題還需要更加深入地研究。