副溶血性弧菌在動態(tài)體外人胃仿生原位消化系統(tǒng)中的存活情況研究

王思琦， 張昭寰， 劉海泉,2,3,4， 潘迎捷,2,3， 趙 勇,2,3*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(上海)，上海 201306； 4.上海海洋大學(xué) 食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種常見的食源性病原菌，是沿海地區(qū)夏秋季引發(fā)食物中毒的重要病原菌之一，對公眾健康構(gòu)成了極大威脅[1]。副溶血性弧菌會引起人體急性胃腸炎，具有腹痛腹瀉、嘔吐惡心、發(fā)燒等臨床癥狀，通常與食用了生的或未煮熟的海鮮密切相關(guān)[2]。該菌最適生長溫度為35～37 ℃，最適生長pH值為7.5～8.5，對酸敏感，在pH值低于6的酸性條件下一般不生長[3]。由于科研條件及道德倫理等方面的限制，往往無法直接對人體消化道進(jìn)行研究[4]，因此，副溶血性弧菌進(jìn)入人胃后的存活情況尚屬研究空白，難以解釋其通過強(qiáng)酸性胃液而導(dǎo)致人體患病的根本原因。目前，可替代活體實驗的人工模擬胃腸道模型主要分為兩類：人工模擬胃腸道靜態(tài)模型及人工模擬胃腸道動態(tài)模型。Mao等[5]使用人工模擬胃腸道靜態(tài)模型對大腸埃希菌的存活進(jìn)行了研究，2014年Minekus等[6]提出了此類模型的標(biāo)準(zhǔn)化“黃金模型”，該模型操作簡便且重復(fù)性良好，但無法模擬胃腸道消化的動態(tài)過程，與實際情況仍存在一定差距。人工模擬胃腸道動態(tài)模型主要有四種：1993年比利時根特大學(xué)Molly等[7]構(gòu)建的SHIME模型(Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem)、1996年荷蘭應(yīng)用科學(xué)研究組織Minekus等[8]構(gòu)建的TIM模型(TNO Intestinal Model)、2015年馬德里自治大學(xué)Barroso等[9]構(gòu)建的SIMGI模型(Simulator of the Gastro-Intestinal tract)及2018年蘇州大學(xué)陳曉東等[10]構(gòu)建的DHSI-IV模型(Dymanic Human Stomach Intestine)。DHSI-IV模型是一種形態(tài)學(xué)、動力學(xué)、胃腸環(huán)境高度仿生的“準(zhǔn)真實”體外消化模型，該模型在未來對臨床、食品、藥品開發(fā)及應(yīng)用等領(lǐng)域具有一定的助力作用。胃是人體消化道中最為極端的環(huán)境，是鹽酸(HCl)分泌的主要部位，空腹胃液pH值在1.0～3.0，是在食物或飲用水中病原菌進(jìn)入腸道之前殺死或滅活病原菌的主要場所。而副溶血性弧菌這一不耐酸性病原菌，在pH值為3.0的酸中處理15 min不能存活[11]，關(guān)于其如何通過人胃這一極端環(huán)境方面的研究基本空白。本研究針對這一問題，創(chuàng)新性地運(yùn)用DHSI-IV模型，以三文魚和南美白對蝦為食物基質(zhì)接種副溶血性弧菌后，對真實胃部消化過程中的食糜排空、胃部pH值變化及接種后的細(xì)菌存活情況進(jìn)行研究，以期后續(xù)以此為基礎(chǔ)建立一個標(biāo)準(zhǔn)化消化模型，進(jìn)一步揭示副溶血性弧菌在人體消化道中的耐受性及致病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 南美白對蝦、三文魚購自上海市浦東區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 菌株 副溶血性弧菌VPD58，本實驗室環(huán)境分離菌株，攜帶種特異基因tlh和毒力基因tdh。

1.1.3 培養(yǎng)基 TCBS瓊脂培養(yǎng)基(硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，PW(Peptone water，添加0.85% NaCl及0.1%蛋白胨，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，TSB液體培養(yǎng)基(胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，添加3% NaCl，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，TSA瓊脂培養(yǎng)基(胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)

1.1.4 試劑與儀器 KCl、KH2PO4、NaHCO3、NaCl、MgCl2·6H2O、(NH4)2CO3、CaCl2·2H2O(分析純，Sigma)，豬胃黏膜胃蛋白酶(≥250 U/mg，Sigma公司)，CombiMax K600料理機(jī)(法國interscience公司)；Eppendorf離心機(jī)(德國Ep-pendorf公司)；高精度恒溫培養(yǎng)箱(日本Sanyan公司)；Bio-Tek酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；動態(tài)體外人胃仿生原位消化系統(tǒng)(蘇州曉東宜健公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 將三文魚和蝦樣品放入熱水中煮沸20 min，在生物安全柜中冷卻后，稱取150 g左右的樣品，加入20 mL無菌水，用滅菌處理后的料理機(jī)，1 500 r/min處理，制備吞咽后的樣品狀態(tài)。另取10 g滅菌樣品，均質(zhì)涂布于TSA培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，如無菌落生長，證明樣品已經(jīng)去除背景微生物。

1.2.2 細(xì)菌懸浮液制備和接種 將副溶血性弧菌VPD58劃線接種至TCBS平板，挑取單菌落至9 mL TSB(3%NaCl)試管中，180 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)10～12 h，連續(xù)活化2次。將培養(yǎng)后的菌液離心10 min(3 600 r/min，25 ℃)，去掉上清液，用PW溶液調(diào)節(jié)OD600至1.2左右，吸取1.6 mL菌液接種于制備好的樣品中，初始接種量7.0 Lg(cfu/g)。

1.2.3 模擬胃液(SGF)的制備 參照Minekua方法配制并經(jīng)0.22 μm濾膜除菌[6]。模擬胃液儲備液(見表1)，配制后4 ℃?zhèn)溆谩ＤM胃液用127.5 mL儲備液，以儲備液為溶劑的濃度為25 000 U/mL的胃蛋白酶溶液27.2 mL，85 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液，用無菌水定容至170 mL，并用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至1.6，現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 模擬胃液儲備溶液的制備

注：a由于鈣可能發(fā)生沉淀，因此將CaCl2·2H2O直接添加到模擬消化液和食物的最終混合物中;“-”表示模擬消化液對CaCl2·2H2O的使用體積不做要求，最終濃度達(dá)到0.075 mmol/L即可

1.2.4 動態(tài)體外人胃仿生原位消化系統(tǒng)及設(shè)定 動態(tài)體外人胃仿生原位消化系統(tǒng)(DHSI-IV模型)包括仿生食道組件及仿生胃組件(圖1)。仿生胃組件包括3D打印硅膠仿生人胃(圖2)，包括胃袋上的幽門和賁門、以偏心輪為主的滾動擠壓裝置、與胃袋相通的胃液管及溫控裝置。仿生人胃是按照真實人胃進(jìn)行3D打印，是典型的“J”形。硅酮皮的厚度為(6.0±1.6) mm，具有良好的彈性和機(jī)械耐受性，允許反復(fù)擠壓而不撕裂，人體胃部模型的內(nèi)部體積約為500 mL。此外，該模型的內(nèi)腔有褶皺，兩根硅膠管(內(nèi)徑1.5 mm，外徑2 mm)連接到胃體，模擬胃分泌腺的作用。管子的另一端嵌入一個連接器(內(nèi)徑10 mm，外徑16 mm)，并安裝了一組單向閥，閥門是用來防止胃里的東西回到分泌管內(nèi)。用蠕動泵將人工胃液打入分泌管。該裝置的各類參數(shù)設(shè)定見表2，溫度維持在正常人體溫37 ℃，模擬胃液的輸入速率見圖3。

圖1 動態(tài)體外仿生原位消化系統(tǒng)

圖2 3D打印胃模型剖面圖

圖3 模擬胃液輸入速率

表2 動態(tài)體外人胃仿生原位消化系統(tǒng)參數(shù)

注：“-”表示對該項參數(shù)不存在

1.2.5 存活率的計算 收集胃排出的食糜，利用平板涂布方法計算菌落數(shù)，并根據(jù)公式：細(xì)菌存活率=瞬時細(xì)菌菌落數(shù)(cfu/g或cfu/mL)/初始接種菌落數(shù)(cfu/g或cfu/mL)，計算細(xì)菌存活率[12-13]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS軟件(version 19.0, SPSS Inc., Chicago, IL)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性檢驗采用ANOVA方法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHSI-IV模型中的食糜排空

如圖4所示，在動態(tài)體外人胃仿生原位消化系統(tǒng)中，模擬消化蝦或三文魚0～30 min時，幾乎沒有食糜排出，三文魚的食糜排出量在60～90 min到達(dá)峰值(79.85±0.35) mL，而蝦在90～120 min到達(dá)峰值(123.00±3.00) mL。在消化120 min后，仍有(98±2.93) mL三文魚糜-胃液混合物和(192±5.19) mL蝦糜-胃液混合物未排出。

2.2 DHSI-IV模型中胃排空出食物pH值的變化

在120 min的消化模擬過程中，動態(tài)體外人胃仿生原位消化系統(tǒng)中胃部pH值的變化如圖5所示。由于食物的稀釋作用，在食物進(jìn)入體外人胃模型的前10 min，pH值從1.60迅速增高至7.30(蝦)和6.40(三文魚)。隨著胃液的不斷分泌以及食物的排空，胃部的酸堿度不斷緩慢降低。其中在90～120 min，模擬消化蝦的胃部pH值降低趨勢強(qiáng)于模擬消化三文魚，與食糜排空的過程同步。在120 min時，消化兩種水產(chǎn)品的胃部pH值均在5.40左右。

圖4 幽門末端的食物殘渣排出量

圖5 DHSI-IV model模擬胃部消化南美白對蝦及三文魚過程中的pH值變化

2.3 DHSI-IV模型模擬消化三文魚時細(xì)菌濃度的變化

收集幽門排出的三文魚食糜后進(jìn)行TCBS平板涂布菌落計數(shù)，結(jié)果如圖6所示，存活率見表3，隨著模擬消化時間的不斷增加，三文魚中副溶血性弧菌的細(xì)菌濃度呈明顯下降趨勢， 10 min時三文魚中細(xì)菌濃度為(4.395±0.115) Lg(cfu/mL)，存活率為(0.248±0.012)%；120 min時，細(xì)菌濃度為(2.865±0.175) Lg(cfu/mL)，存活率為(0.007±0.005)%，0～10 min副溶血性弧菌細(xì)菌濃度下降趨勢最大，見表4。

圖6 體外消化過程中接種在三文魚糜中副溶血性弧菌細(xì)菌濃度變化

表3 體外消化過程中三文魚糜中副溶血性弧菌的存活率

2.4 DHSI-IV模型模擬消化南美白對蝦時細(xì)菌濃度的變化

收集幽門排出的南美白對蝦食糜后進(jìn)行TCBS平板涂布計數(shù)，結(jié)果見圖7，存活率見表3，隨著模擬消化時間的不斷增加，三文魚中的副溶血性弧菌細(xì)菌濃度數(shù)值呈明顯下降趨勢， 10 min時三文魚中細(xì)菌濃度為(6.107±0.075) Lg(cfu/mL)，存活率為(13.490±0.011)%;120 min時，細(xì)菌濃度為(4.219±0.078) Lg(cfu/mL)，存活率為(0.119±0.025)%;20～30 min副溶血性弧菌細(xì)菌濃度下降趨勢最大，見表4。

圖7 體外消化過程中接種在南美白對蝦糜中副溶血性弧菌細(xì)菌濃度變化

表4 體外消化過程中南美白對蝦糜中副溶血性弧菌的存活率

3 討 論

胃的消化過程是一個物理和化學(xué)作用結(jié)合的過程。分解被攝取的物質(zhì)，同時清空小顆粒和液體，這一過程被稱為胃排空[14]。Bornhorst等[15]報道不同種類的米(精米和糙米)在豬模型中的胃排空速率，Johansen等[16]測定了裝有胃插管的豬(以小麥和燕麥為基礎(chǔ)的飼料)的胃排空淀粉情況，均發(fā)現(xiàn)淀粉具有相似的排空率。但本研究得出的不同蛋白質(zhì)食物的胃排空速率則并不相似，蛋白質(zhì)的排空可能不同于食物中淀粉的排空。胃中食物分解率在決定胃排空和營養(yǎng)吸收等其他過程中起著關(guān)鍵作用，但其規(guī)律目前還不完全清楚[17]。由于胃形態(tài)的“J”形特征，食物混合物會在體外胃模型中分層，胃中“食物”的排空過程會出現(xiàn)一個滯后的過程[18]。Collins等[19]利用志愿者研究了葡萄糖-碎牛肉-雞肝混合物組成的食物的胃排空，其滯后時間在56 min。本研究結(jié)果表明三文魚排空的滯后期在0～30 min，而南美白對蝦的滯后期長達(dá)90 min。滯后階段是高度個人化的，在一些人體研究中，有些受試者的滯后階段可能長達(dá)90 min[20]。這一食糜的排空峰值出現(xiàn)的差異，不僅與胃液的分泌相關(guān)，與食物種類相關(guān)、還與食物的卡路里[21]、食物成分[22]有關(guān)。

胃液中的酸具有水解碳水化合物、激活胃蛋白酶、提供適宜的反應(yīng)環(huán)境的功能[23]。本研究中在食物攝入DHSI-IV模型后的前10 min內(nèi)，pH值的變化表明了三文魚和南美白對蝦對胃酸的緩沖作用，這一緩沖作用在其他體內(nèi)研究中也有同樣的發(fā)現(xiàn)：在進(jìn)食后半小時內(nèi)胃部pH值快速升高后，人體往往需要2～4 h將胃部pH值降低到初始值[24-25]。副溶血性弧菌在人體消化道的存活是其致病機(jī)制的關(guān)鍵，本研究數(shù)據(jù)表明，在食品消化120 min進(jìn)入腸道后，副溶血性弧菌并沒有完全被胃酸殺滅，對蝦中該菌的存活率為(0.119±0.025)%，而三文魚中存活率為(0.007±0.005)%。與三文魚相比，對蝦中的副溶血性弧菌能更好的通過胃部到達(dá)腸道。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是副溶血性弧菌隨食品攝入后，食物基質(zhì)導(dǎo)致胃酸大幅升高，從而使副溶血性弧菌能夠免遭胃液的殺滅，并通過胃排空進(jìn)入腸道，而導(dǎo)致人體致病。

綜上所述，本研究運(yùn)用DHSI-IV模型模擬并描述了食物中的副溶血性弧菌在人胃中的存活情況：在消化早期，隨著食物的消化分解，胃部pH值不斷升高，使得副溶血性弧菌這一不耐酸的致病菌能夠避免胃液的殺滅作用，通過胃排空進(jìn)入腸道而引起致病。但由于人體消化是一個十分復(fù)雜的過程，且消化過程還涉及一系列復(fù)雜的神經(jīng)調(diào)控和免疫應(yīng)激，并且不同人群、不同食物、不同飲食習(xí)慣等狀況均易產(chǎn)生不同的消化行為。因此，后續(xù)研究將進(jìn)一步通過大量試驗來收集數(shù)據(jù)，開發(fā)設(shè)計出一種更接近真實人體消化的理想模型，為對副溶血性弧菌致病機(jī)制的揭示、微生物風(fēng)險評估、副溶血性弧菌的治療和疫苗的開發(fā)提供強(qiáng)有力的科研工具。