兔結(jié)核病模型的應(yīng)用研究進(jìn)展

涂振陽， 藍(lán)常貢， 謝克恭， 陸敏安， 農(nóng) 峰， 梁俊卿， 唐盛斐

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院心胸外科，廣西 百色 533000；4. 廣州市紅十字會醫(yī)院 超聲診斷科，廣東 廣州 510235)

結(jié)核病(tuberculosis,TB)是具有強烈傳染性慢性消耗性的疾病，可侵染全身多個器官。1882年德國Robert Koch發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)以來[1]，對MTB感染途徑及TB的發(fā)病機制已有較深入的認(rèn)識。1921年Calmette和Guerin研制的卡介苗(bacillus calmette guerin,BCG)首次應(yīng)用于人類，BCG的普及很大程度上降低了TB新病例發(fā)生[2]。雖然TB疫苗和抗結(jié)核藥物的研究取得了一定的成就，但對TB的防治仍存在局限性。這就要求我們的研究更加具有創(chuàng)新性和前瞻性。動物TB模型已成為國內(nèi)外研究TB病理生理學(xué)、診斷學(xué)和評價治療方案的關(guān)鍵模型。目前10余種動物被用于TB模型的研究，最常見的有小鼠、豚鼠、兔、恒河獼猴、食蟹獼猴等。雖然沒有一種動物包括非人類靈長動物(nonhuman primates,NHP)能夠完全復(fù)現(xiàn)人類TB的臨床表現(xiàn)，但與嚙齒動物和NHP相比，兔不僅是MTB的宿主和攜帶者，而且其免疫系統(tǒng)與人類相似度較高[3]。兔TB模型對抗結(jié)核藥物和疫苗的研發(fā)以及TB發(fā)病機制的了解作出了重大貢獻(xiàn)，是從臨床前研究跨越到臨床研究的重要橋梁。本文就兔免疫機制及近年來基于兔TB模型研究人類多個系統(tǒng)TB所取得的進(jìn)展作一綜述。

1 兔TB模型的特點

1.1 兔TB模型簡介

MTB是胞內(nèi)致病菌，其免疫機制主要是以T細(xì)胞參與為主的細(xì)胞免疫反應(yīng)。通過融合吞噬體-溶酶體[4]，長期存留在巨噬細(xì)胞內(nèi)。MTB是一種人畜共患的病原體，其致病特點為TB實驗?zāi)Ｐ驮趧游锓N類的選擇上提供更多的可能性。兔TB模型的應(yīng)用歷史久遠(yuǎn)，繼1881年Louis Pasteur構(gòu)建兔實驗?zāi)Ｐ统晒ρ邪l(fā)狂犬疫苗以來[5]，1882年Robert Koch首次在兔體內(nèi)種植MTB，建立了真正意義上的兔TB模型[6]。1964年 Lurie[7]旨在研究先、后天防御機制對TB耐藥性的作用，開創(chuàng)性構(gòu)建耐藥的兔TB模型，為進(jìn)一步研究宿主對MTB感染的遺傳易感性奠定了基礎(chǔ)。隨后出現(xiàn)了多種TB的研究模型，包括兔Pott病模型、兔骨關(guān)節(jié)TB模型、兔泌尿生殖系統(tǒng)TB模型以及兔消化系統(tǒng)TB模型等。兔TB模型將繼續(xù)為揭示多種復(fù)雜的人類TB發(fā)病機制和制定更好的防治策略方面發(fā)揮重要作用。

1.2 兔TB模型相關(guān)免疫機制

對兔TB 模型免疫機制的深入研究，有助于更進(jìn)一步了解兔與人類對MTB感染后免疫反應(yīng)的異同點，為兔在TB模型的應(yīng)用提供更多依據(jù)。MTB感染后，CD4+T細(xì)胞可分化為Th1和Th2、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells,Treg)等細(xì)胞[8]，Th1細(xì)胞參與細(xì)胞遲發(fā)性超敏反應(yīng)，能增強宿主對MTB的防御能力；Th2參與體液免疫應(yīng)答。Th1和Th2之間免疫反應(yīng)的平衡對于宿主抗MTB至關(guān)重要。Th1和Th2失衡可導(dǎo)致免疫功能下降，從而削弱機體抵抗感染的能力[9]。其中細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-4、IL-13和TNF-α等發(fā)揮重大作用，這些細(xì)胞因子決定著未成熟T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分化方向[10]。有研究指出，IL-4可促使未成熟T細(xì)胞向Th2方向分化，而IFN-γ可促進(jìn)細(xì)胞向Th1方向分化[11]，同時巨噬細(xì)胞在IFN-γ作用下產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、趨化因子和殺菌分子。MCP-1和趨化因子配體2(C-C chemokine ligand 2,CCL2)是趨化因子家族的重要成員，且MCP-1是巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化的重要因子[12]。常見的殺菌分子包括一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADP oxidase NOX)等，可增加巨噬細(xì)胞對MTB感染的防御能力。但實驗指出，IL-4可阻止巨噬細(xì)胞活化，導(dǎo)致選擇性活化吞噬細(xì)胞的產(chǎn)生，進(jìn)而增加精氨酸酶-1(arginase-1 ARG1)和過氧化物酶體增殖激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPAR-γ)等免疫介質(zhì)，同時減少iNOS的表達(dá)，故在感染早期降低宿主巨噬細(xì)胞對MTB控制效率[13]。Treg是一種特殊類型的免疫抑制細(xì)胞，在感染MTB時，高水平的TGF-β可以促進(jìn)Treg的分化，使效應(yīng)T細(xì)胞的免疫功能受到極大的抑制。研究證實MCP-1和TGF-β的高表達(dá)與宿主免疫功能下降密切相關(guān)[14]。Subbian等[15]對兔TB免疫反應(yīng)進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)，感染后4周肺部的MTB成倍繁殖，并在12周內(nèi)保持高負(fù)荷狀態(tài)，于16周肺結(jié)核空洞逐漸形成。同時發(fā)現(xiàn)IFN-γ和IL-4在整個過程逐漸增加，在12到16周達(dá)到高水平，此研究為兔TB在不同免疫反應(yīng)階段的病理特征作出詳述，為進(jìn)一步研究提供可實驗依據(jù)；Guo等[16]發(fā)現(xiàn)兔TB外周血中MCP-1和NF-κβ表達(dá)水平處于較高狀態(tài)，因此推斷宿主早期通過先天性免疫反應(yīng)及T細(xì)胞的活化抗MTB感染，這與人類抗結(jié)核免疫反應(yīng)表現(xiàn)出高度的一致性。

1.3 兔TB模型的優(yōu)勢和局限性

動物模型已成為模仿人類傳染病并研究該疾病的重要途徑。目前用于構(gòu)建TB模型的動物主要包括嚙齒、NHP以及兔等。但因不同模型之間在易感性和病理反應(yīng)方面存在著一定的差異，故不同的動物TB模型各具優(yōu)勢和局限性。兔不僅可以攜帶MTB，還是MTB 的宿主，與人類TB病理反應(yīng)相似度較高。因兔體型介于嚙齒動物和非人類靈長動物之間，且具有再現(xiàn)性好、動物背景資料完整、復(fù)制率高和專一性好等優(yōu)點。盡管兔TB模型是重要、可靠的動物模型，但仍存在一定的局限性，面臨眾多挑戰(zhàn)，如TB動物實驗要求在生物安全三級(Animal biosafety level-3,ABSL-3)實驗室內(nèi)進(jìn)行，很大程度上限制了兔TB模型的廣泛開展；同時兔TB模型缺乏相關(guān)免疫試劑，阻礙了兔TB模型的多樣化研究。

2 兔TB模型的應(yīng)用價值

2.1 兔TB模型在抗結(jié)核藥物中的應(yīng)用價值

2.1.1 抗結(jié)核藥物及其相關(guān)機制 抗結(jié)核藥物的研制對降低TB發(fā)病率具有重大意義，目前常見的一線抗結(jié)核藥物[17]主要包括異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)等，而對氨基水楊酸、對氨基水楊酸異煙肼、環(huán)絲氨酸、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺、特列齊酮等主要作為二線抗結(jié)核藥物用于臨床。由于TB的廣泛耐藥、耐多藥的出現(xiàn)，嚴(yán)重降低了抗結(jié)核藥物的療效。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，約20%的MTB至少對其中一種抗結(jié)核藥物具有耐藥性，而且耐多藥TB的發(fā)病率有上升趨勢[18]。耐藥的出現(xiàn)可能與長時間使用抗結(jié)核藥物以及基因多態(tài)性等因素有關(guān)。如何充分利用兔TB模型作為研究載體，將現(xiàn)有抗結(jié)核藥物的療效最大化并縮短治療時間，從而避免耐藥TB 的產(chǎn)生，是目前研究的重點之一。1951年INH開始用于臨床治療TB，其作用機制是阻止MTB與核酸的結(jié)合，然而長期服用INH可導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，MTB中katG基因突變是INH的耐藥機制之一[19]。1972年RFP用于抗結(jié)核治療，主要通過抑制MTB的RNA多聚酶從而阻止mRNA 的合成[20]。一旦形成耐藥，可同時伴有異煙肼耐藥的出現(xiàn)。PZA生成吡嗪酸后抑制結(jié)核分枝桿菌脫氫酶殺菌[21]，20世紀(jì)70年代，隨著PZA的臨床應(yīng)用，治療時間大為縮短，但迄今為止PZA在TB的治療機制上仍存在一定爭議。EMB主要作用于阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶并影響細(xì)胞壁的形成，常用于抑制繁殖期的MTB感染,有報道指出谷氨酸外消旋酶作為EMB的一個靶點，是MTB在I期肽聚糖生物合成途徑的關(guān)鍵酶[22]。了解現(xiàn)有藥物的作用機理和作用位點為抗結(jié)核實驗研究指明了方向。

2.1.2 兔TB模型在抗結(jié)核藥物中的應(yīng)用進(jìn)展 如何避免耐藥TB的出現(xiàn)并將抗結(jié)核藥物療效最大化，是TB治療的研究重點。戈朝輝等[23]利用新西蘭大白兔脊柱TB模型，發(fā)現(xiàn)INH、RFP白蛋白納米粒與INH、RFP普通制劑相比具有良好的體內(nèi)緩釋型，在兔TB模型的治療效果中前者顯著優(yōu)于后者。兔TB模型還可用于評價脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與RFP緩釋微球復(fù)合物的療效，結(jié)果顯示該復(fù)合物可有效抑制MTB生長，減少椎體骨質(zhì)破壞[24]。Blanc等[25]利用兔TB模型證明PZA可有效殺死病灶中的MTB，且治療2個月后抗結(jié)核強度較前明顯加大。雖然臨床通過藥代動力學(xué)檢驗證明，EMB的抗結(jié)核的應(yīng)用價值有限，但Zimmerman等[26]通過兔TB模型分析時發(fā)現(xiàn)，EMB對結(jié)核病灶的穿透性較強，而抗結(jié)核藥物對病灶的穿透性也是抗結(jié)核藥物研發(fā)的重點項目之一。由于耐藥的TB患者長期使用抗結(jié)核藥物，可能因肉芽腫低氧微環(huán)境導(dǎo)致病灶高度纖維化，因此藥物對肉芽腫滲透差，Datta等[27]構(gòu)建TB模型，運用抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子治療MTB破壞脈管系統(tǒng)的兔TB模型，并檢測低分子量示蹤劑在肉芽腫周圍的分布，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)治療的人類和兔TB肉芽腫中血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋率較低，經(jīng)抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子抗體貝伐單抗治療TB感染家兔，貝伐單抗治療促進(jìn)了結(jié)核肉芽腫血管正?；纳菩》肿觽鬟f，減少缺氧，從而為改善當(dāng)前治療方案在療效上提供了一個潛在的途徑。對MTB感染風(fēng)險分析發(fā)現(xiàn)，治療慢性炎性疾病和使用TNF-α拮抗劑等可增加患TB的風(fēng)險。Tsenova等[28]研究結(jié)果證實了以上觀點。此實驗證明兔TB模型對人類免疫調(diào)節(jié)試劑的研究具有可行性。故兔TB模型的應(yīng)用很大程度上提高了對TB發(fā)病機制的認(rèn)識，同時提高了現(xiàn)有抗結(jié)核藥物的治療水平。

2.2 兔TB模型在疫苗評價中的價值

2.2.1 TB疫苗 疫苗是經(jīng)過誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫，保護(hù)人類和動物免受傳染病和非傳染病侵害的最有效的方法之一。TB疫苗的使用很大程度上降低了TB擴散蔓延。但疫苗的研制多數(shù)尚處于臨床前和臨床開發(fā)階段，目前疫苗的研發(fā)[29]包括基礎(chǔ)性免疫疫苗VPM1002和MTBVAC；增強性免疫疫苗如亞單位疫苗Hybrid1-IC31、Hybrid1-CAF01、H56、IC31、H4、LT70、M72和D93；病毒載體疫苗如修飾痘病毒 Ankara株(modified vaccine virus Ankara MVA)；全細(xì)胞疫苗如DAR-901；疫苗免疫佐劑如IC31和AS01E；治療性疫苗如Ruti和SRL-172。但被允許廣泛應(yīng)用于臨床預(yù)防TB是法國科學(xué)家近100年前研制的減毒活疫苗BCG，全世界范圍內(nèi)約40億人已接種BCG，覆蓋率高達(dá)90%[30]，但該疫苗并不能完全杜絕TB，對有效新疫苗的研發(fā)仍有很大的提升空間。

2.2.2 兔TB模型在TB疫苗中的應(yīng)用進(jìn)展 動物模型對于疫苗的評價和開發(fā)是必不可少的。目前已有超過35種動物被用于1 300余種疫苗的實驗測試[31]，但是利用動物模型進(jìn)行疫苗研究仍存在種種挑戰(zhàn)，動物模型的選擇也是疫苗研制者爭論的焦點之一。人們一直以來嘗試建立多種不同動物模型來測試候選疫苗，但每種動物模型都無法完全復(fù)制疾病在人類發(fā)生的特征。雖然NHP和牛與人類抗結(jié)核的免疫機制十分接近，但鑒于成本高昂、飼養(yǎng)條件苛刻，因此容易受樣本數(shù)量的限制；豚鼠和小鼠等嚙齒動物是研究多種疾病疫苗最常用的動物模型，然而在對MTB感染后免疫過程的觀察中發(fā)現(xiàn)，豚鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)較弱，而小鼠產(chǎn)生遲發(fā)性超敏反應(yīng)，難以復(fù)制人類TB的臨床表現(xiàn)。家兔作為動物模型優(yōu)于嚙齒動物，兔TB模型能夠形成類似于人類的干酪樣壞死和空洞，可用于多種結(jié)核疫苗的研究?；A(chǔ)性免疫疫苗VPM1002最初是為了提高M(jìn)TB抗原參與MHC I通路，通過李斯特菌溶胞素(listeriolysin O，LLO)微擾吞噬體膜介導(dǎo)的抗原胞質(zhì)向外轉(zhuǎn)移，從而提高BCG株誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的能力。此外，組織蛋白酶等吞噬溶酶體蛋白酶泄漏到細(xì)胞質(zhì)能夠激活凋亡蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和隨后MTB抗原的交叉表達(dá)，促進(jìn)MHC I和MHC II限制性T細(xì)胞表達(dá)[32]。Velmurugan等[33]對VPM1002和BCG的安全性進(jìn)行了比較，通過構(gòu)建幼兔TB模型，復(fù)制嬰幼兒對VPM1002反應(yīng)，證實VPM1002的臨床前安全性。Chen等[34]進(jìn)行TB疫苗LT70研究時，設(shè)置了一種BCG試驗性給藥兔皮膚TB模型，發(fā)現(xiàn)亞單位疫苗LT70和 EAMM-MH聯(lián)合應(yīng)用在兔皮膚TB模型中顯示出良好的保護(hù)效果，為TB疫苗評價提供了一種直觀、簡便的新模型。另外一項研究，Li等[35]建立了兔肺卡介苗潛伏期感染模型，LT70亞單位疫苗在MTB潛伏期或增殖期的相關(guān)抗原結(jié)果顯示出比傳統(tǒng)疫苗更好的治療效果。Liu等[36]用其他動物建立TB模型，實驗結(jié)論與LI一致，證明兔試驗?zāi)Ｐ涂煽?。兔TB模型是疫苗研制的重要動物模型，針對不同實驗?zāi)康?，設(shè)計可準(zhǔn)確檢測疫苗有效性的多樣化兔TB模型是研制TB疫苗的重要環(huán)節(jié)。

2.3 兔TB模型在Pott病中的應(yīng)用進(jìn)展

Pott病[37]是MTB入侵易感人群后累及脊柱和神經(jīng)的疾病,發(fā)病率約占骨關(guān)節(jié)TB的50%,若不及時治療或治療不當(dāng)可能導(dǎo)致椎體骨質(zhì)破壞、脊柱畸形, 甚至脊髓受壓亦或重度感染危及生命。研究發(fā)現(xiàn)，Pott病神經(jīng)系統(tǒng)受累的發(fā)生率約為10%～47%[38]，是主要威脅全球公共衛(wèi)生的疾病之一。因此充分合理利用現(xiàn)有動物模型，深入研究MTB誘發(fā)Pott病的發(fā)病機制具有重要意義。不同的MTB菌種、濃度的配置、手術(shù)入路均可對實驗結(jié)果產(chǎn)生重大影響。用于構(gòu)建兔Pott病模型的MTB主要包括強毒型菌株H37Rv，減毒型或無毒性菌株H37Rva、Erdman、北京家族、馬來西亞菌株。在造模過程中若MTB懸液濃度過高容易導(dǎo)致兔中毒死亡，濃度過低可因未感染而導(dǎo)致造模失敗。H37Rv最初分離于H37，用于構(gòu)建兔Pott病模型的常用濃度為5 mg/mL，注射量為0.2 mL，第4～6腰椎常作為感染部位，隨著病程發(fā)展可形成包括肉芽腫等類似人類TB的病理特征。Liu等[39]在研究通過將H37Rv植入新西蘭白兔的腰椎，建立兔Pott病模型時，測得造模成功率為68.1%，與Geng等[40]造模成功率89.5%相比具有差異性，可能與兔樣本量、菌株種植部位不同及兔飼養(yǎng)環(huán)境等有關(guān)。

兔Pott病模型在治療上同樣作用意義重大，Wang等[41]研究發(fā)現(xiàn)，在新西蘭大白兔TB模型中，異奎硫原蛋白可通過抑制免疫反應(yīng)有效緩解脊柱TB。病灶清除植骨融合內(nèi)固定術(shù)是目前Pott病的外科治療方式，內(nèi)固定植入人體后，MTB可依靠自身特有結(jié)構(gòu)，同時分泌細(xì)胞外多黏質(zhì)物質(zhì)(extracellular slime substance,ESS)，通過與細(xì)胞外基質(zhì)共同形成生物膜并不斷繁殖，形成耐藥，導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)。因此通過兔Pott病模型進(jìn)行內(nèi)固定材料的篩選，尋找更多的臨床內(nèi)固定材料，為Pott病成功治療提供保障。孫厚杰等[42]利用兔Pott病模型對鈦金屬材料和 n-HA/PA66人工材料進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)后者表面黏附菌量明顯增多，故推測作為植入材料，鈦金屬材料優(yōu)于n-HA/PA66。同樣兔脊柱結(jié)核模型還可用于Pott病的術(shù)后護(hù)理研究及影像學(xué)研究[43]，更加豐富了兔結(jié)核模型對Pott病的診治內(nèi)容。

2.4 在其他疾病的應(yīng)用進(jìn)展

MTB感染創(chuàng)面是結(jié)核桿菌侵犯織皮膚軟組織所致，治療不當(dāng)容易導(dǎo)致病區(qū)遷延不愈。Zhang等[44]構(gòu)建了新西蘭兔MTB感染創(chuàng)面模型，探討堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)對創(chuàng)面清創(chuàng)后愈合的影響，發(fā)現(xiàn)bFGF可單獨或聯(lián)合抗結(jié)核藥物促進(jìn)創(chuàng)面愈合，且效果顯著優(yōu)于單獨使用抗結(jié)核藥物。膀胱TB常因結(jié)核分枝桿菌刺激使膀胱收縮導(dǎo)致容量減少，最后發(fā)展為完全閉塞，是膀胱切除術(shù)的指征之一。若及時發(fā)現(xiàn)，早期規(guī)律用藥可以恢復(fù)膀胱功能，避免膀胱切除。兔TB模型可為膀胱結(jié)核病的治療提供實驗依據(jù)，Yudintceva等[45]以新西蘭兔膀胱結(jié)核模型為研究對象，采用自體骨間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)評價膀胱功能恢復(fù)的療效，證實向膀胱黏膜層給予MSCs可顯著減少膀胱壁的變形和炎癥，并抑制纖維化，促進(jìn)干細(xì)胞在膀胱內(nèi)再生，豐富了膀胱TB臨床治療方式。中樞神經(jīng)系統(tǒng)TB是最嚴(yán)重的一種肺外結(jié)核病，對兒童的影響尤為嚴(yán)重。建立一種具有兒童結(jié)核性腦膜炎特征的兔模型，不僅可用于評估神經(jīng)功能障礙、細(xì)菌菌量、死后微生物學(xué)和病理學(xué)變化，還可為診治結(jié)核性腦膜炎與兒童大腦發(fā)育相關(guān)疾病提供新的方法[46]。同時，兔還可以勝任包括生殖系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)TB等多種不同系統(tǒng)的動物模型，為TB的診治提供更廣闊的思路。

3 展 望

目前動物TB模型的構(gòu)建已成為TB防治工作的重要部分，但由于MTB是人畜共患的病原體，結(jié)核菌株可在動物間傳播，甚至可感染人群，所以構(gòu)建動物TB模型對實驗室生物安全的級別要求較高，阻礙了兔TB模型的廣泛構(gòu)建。因此研發(fā)新型結(jié)核菌株在種植兔后不僅在病理表現(xiàn)上與人類高度一致，且在動物間或人畜間無傳播性是當(dāng)前研究的重點內(nèi)容之一。不同菌株濃度和不同種植途徑均可影響模型構(gòu)建的成功率，建立兔TB模型評價標(biāo)準(zhǔn)，有助于提高實驗成功率，優(yōu)化兔TB模型。隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，有望構(gòu)建結(jié)核易感的兔TB模型來彌補現(xiàn)有模型缺陷，達(dá)到快速評估和制定可靠的治療方案的目的，為臨床實驗節(jié)省寶貴的時間和經(jīng)費支出，為TB的防治提供新的技術(shù)。