DNA雙鏈斷裂損傷焦點的定量計算和分析方法研究進展

尤培蒙，黎 晨，王晨曦，何俊霞，肖文媛，趙 晉

(西北民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

DNA雙鏈斷裂(Double strand breaks,DSBs) 由內(nèi)在的細胞進程或外在的基因毒性造成,是DNA損傷最嚴重的一種,不及時修復(fù)則可引起細胞周期檢查點停滯并發(fā)生細胞死亡，更大危害是不被修復(fù)和錯誤修復(fù)的DSB可誘導(dǎo)細胞基因組不穩(wěn)定而呈現(xiàn)惡性表現(xiàn)[1].

DSBs形成后會立刻激活細胞的DNA損傷應(yīng)答機制，使DNA雙鏈斷裂點以及附近的組蛋白H2AX，53BP，TRF2，ATM等迅速磷酸化[2]，聚集在雙鏈斷裂處感應(yīng)和放大DNA損傷信號并募集修復(fù)蛋白對DSBs進行修復(fù).這些磷酸化的組蛋白大量聚集在DSBs處成為損傷灶點即焦點(Foci)[3].使用免疫熒光染色分析技術(shù)，借助高對比度、高分辨率及可重建三維圖像的獨特優(yōu)勢的激光共聚焦顯微鏡獲取圖像就可以量化灶點數(shù)目，用于評價 DSBs的數(shù)量和位置，從而評價DNA雙鏈斷裂損傷的程度[4].目前常用于定量計算和分析焦點的方法有基于ImageJ軟件的Focipicker 3D粒子計數(shù)器[5]和collect cell tool細胞處理工具的AutoFoci自動焦點計數(shù)法[6]，F(xiàn)ocicounter軟件[7]，CellProfiler Analyst(CPA)細胞輪廓分析器[8]，F(xiàn)oCo算法工具[9]，新型算法識別系統(tǒng)[10]等.

1 定量計算和分析焦點算法工具

1.1 ImageJFocipicker 3D粒子計數(shù)器

該技術(shù)首先搜索圖像最大中心，然后從中心擴展到局部閾值定義的焦點邊緣，它在識別出焦點后，可以通過T值(定義焦點內(nèi)像素的最小亮度范圍)，V值(定義一個焦點所包含的最小面積)，R值(定義識別粒子的最小半徑)條件對結(jié)果進行過濾[11].它可以分析識別對象的體積、面積、強度和坐標，并將結(jié)果存儲，同時識別對象可在單獨的圖像堆棧中以不同的顏色顯示.

1.2 應(yīng)用collect cell tool細胞處理工具AutoFoci自動焦點計數(shù)法

AutoFoci檢測包含foci和非特定背景信號的對象進行記錄各種對象屬性，如強度、大小和銳度.對象屬性的組合與人工分類相關(guān)聯(lián)，并給出了一種雙模態(tài)對象分布，可用于區(qū)分焦點背景信號[12].

使用ImageJ的Collect cell tool軟件工具從獲取DAPI通道的5張堆棧圖像中識別單個細胞核，并對其進行裁剪以獲得單細胞圖像[13].然后從5張堆棧圖像中選擇對比度最高，非特定焦點影響小的一張進行進一步分析，并將背景信號與所有5個平面的最大強度投影進行比較，完成所有圖像采集和處理步驟.應(yīng)用AutoFoci算法設(shè)置對象評價參數(shù)(OEP)的閾值便，標識單元內(nèi)的對象細胞核，背景信號以及焦點，獲得雙模態(tài)對象分布實現(xiàn)DSBs的自動評分[14].

1.3 Focicounter軟件

FociCounter是一個簡單的聚焦標記程序，它可以繪制多個幀數(shù)的測量圖像，通過調(diào)整細胞圖像參數(shù)閾值如MSS(median square side中值濾波器)EP(enhancement parameter對比度)CR(crown radius焦點邊緣識別半徑)RR(rim radius焦點識別半徑)BD(brightness difference亮度)計算獲得最佳檢測焦點[7].計數(shù)結(jié)果包括檢測到的焦點個數(shù)、焦點亮度和細胞亮度，用于獲得這些結(jié)果的參數(shù)集合同樣也能保存下來進行比較分析.

1.4 CellProfiler Analyst (CPA)細胞輪廓分析器

CellProfiler Analyst (CPA)是一個高通量、基于圖像的實驗數(shù)據(jù)圖像分析軟件.CPA軟件使用高分辨率細胞分類器識別細胞核的細微差別進行預(yù)分類，實現(xiàn)對一定數(shù)量的對象進行快速檢索，通過人工設(shè)置多組濾鏡識別參數(shù)對分類圖像組進行焦點的搜尋，記錄，并進行計算焦點陰性和陽性比率[15].

1.5 Foco聚焦量化算法

聚焦量化算法Foco是一個開源的算法工具，它具有用于單個焦點計數(shù)的GUI(圖形用戶界面)，適用于單個細胞顯微圖像中各種細胞核病灶的計數(shù).該算法只需要調(diào)整5個參數(shù)就能夠可靠地量化密集分布的病灶，例如受輻射劑量高達10 Gy的細胞圖像病灶密集程度很高，即使在低信噪比和密集分布的聚焦情況下，F(xiàn)oco也能夠產(chǎn)生可靠和穩(wěn)定的聚焦量化[7][9][12].表1匯總了五種計數(shù)和分析方法的主要特點.

表1五種定量計算焦點的分析方法和算法工具的比較

2 定量計算和分析病灶過程中問題的解決方法

2.1 參數(shù)校準問題

在使用ImageJ，F(xiàn)ocicounter等粒子計數(shù)和圖像處理軟件分析計算焦點foci時，選擇不同的R值，V值，T值進行對選取對象過濾所得結(jié)果有很大的差異.例如在ImageJFocipicker 3D粒子計數(shù)器計數(shù)中選取的“Minimum pixels number in the focus(焦點的最小像素)”的參數(shù)調(diào)整要在1～3 pixels以內(nèi)，不同的參數(shù)所得的焦點數(shù)是不同的.KroeberJ等人解決思路是進行Bland-Altman分析又稱為數(shù)據(jù)偏倚分析[16].用2～3組不同的參數(shù)計算分析焦點數(shù)，得出測量結(jié)果“一致性界限”，并用圖形的方法直觀地反映出這個一致性界限——通常以測量結(jié)果的差值為縱軸，以測量結(jié)果的均數(shù)為橫軸，繪制散點圖進行校準.同時需要用流式細胞術(shù)，細胞凋亡實驗和細胞克隆實驗作為參考，驗證這個一致性界限的準確性[17]，也可區(qū)別細胞凋亡或其他原因引起的DNA損傷灶點和正?；衔镞z傳毒性導(dǎo)致的灶點的假陽性.校準后的數(shù)據(jù)才更具有準確性和真實性.

2.2 雙染雙標焦點計數(shù)問題

在使用ImageJ，AutoFoci等粒子計數(shù)和圖像處理軟件分析計算焦點foci既能夠進行單染單標的焦點計算，也能夠進行雙染雙標的焦點計數(shù)，而且可以解決DNA損傷雙染雙標灶點位置毗鄰或重疊的問題.根據(jù)Laia Hernández等人在進行γH2AX焦點計數(shù)和細胞周期分類是提供的思路[18]，例如進行TRF2和53BP雙標雙染的圖像分析時，可以捕獲紅(53BP)+綠(TRF2)+藍(DAPI)和紅(53BP)+綠(TRF2)+藍(DAPI，激光通道關(guān)閉)圖像分別記錄保存再使用軟件進行分析，定位細胞核記錄紅色和綠色焦點量，以及紅+綠總量做以下差值運算：S1=Number of green dots—(Amount—Number of red dots)S2=Number of red dots—(Amount—Number of green dots)再做偏倚校準.如果分析焦點時出現(xiàn)假陽性，可參考LengertN，MirschJ等人經(jīng)過將近50萬個細胞焦點的計數(shù)的運算方法即Actual Value(真實值)=True-Positives(真陽性量)/(True-Positives+false-positives)獲取有效的焦點計數(shù)[6][14].

2.3 灶點空間位置重疊問題(Foci overlap)

激光共聚焦顯微鏡使用獲取的掃描圖像是一種特殊的復(fù)合圖像，在分析和計算損傷灶點的時候，會出現(xiàn)細胞核空間位置在圖像中的重疊，或者不同層次的焦點亮度在圖像中表現(xiàn)差異，使得計數(shù)的準確性降低.免疫熒光圖像數(shù)據(jù)獲取過程中LengertN，Mirsch J等人采用AutoFoci計數(shù)分析法的cell collect tool工具[12][13]，González JE，Lee M等人使用cell profile工具進行處理[15][19].以AutoFoci分析法為例，它要求使用掃描顯微鏡以DAPI通道檢測標志物的5層圖像圖像，并選擇高對比度識別信號強度最大的圖像投影進行運算和分析.實驗過程中仍需要記錄每個圖層的參數(shù)數(shù)據(jù)便于矯正和參數(shù)的選用.

2.4 細胞核無效量問題

此問題一般出現(xiàn)在人工計算分析焦點時，由于免疫熒光實驗過程中細胞本身的因素造成細胞核無效量增多，核灶點準確性降低，人工選取細胞核也會有很大誤差，主要表現(xiàn)在細胞核圖像DAPI藍色通道有很多核外染色偽影，細胞核變性[20].避免這個問題首先要保證免疫熒光實驗過程中細胞狀態(tài)良好，細胞量正?；蚵远?，可以保證細胞核有效量.其次使用AutoFoci計數(shù)分析法的cell collect tool工具，cell profile圖像處理工具進行智能圖像選取.圖像選取有效量高，計算和分析焦點時，才盡最大可能的消除細胞核出現(xiàn)灶點無效量.

2.5 核灶點亮度(Foci brightness)和核灶點面積(Foci area)問題

免疫熒光激光共聚焦定位技術(shù)是反映DNA雙鏈斷裂損傷最直觀的檢測項目，即對DNA損傷的灶點數(shù)量和灶點位置算法分析.但是因細胞種類的不同，實驗細胞的狀態(tài)，或者是引起細胞DNA雙鏈斷裂損傷的原因不同，引起的焦點亮度(Foci brightness)，細胞核亮度(cell brightness)以及焦點面積(Foci area)的期望值和實際值偏差[5][9].目前相關(guān)研究未給出確切的解決方案.

3 結(jié)語

測定DNA雙鏈斷裂損傷方法有很多，如流式細胞術(shù)、中性彗星電泳實驗等[21，23]，而選用免疫熒光技術(shù)通過激光共聚焦圖像可反映出不同損傷灶點位置和損傷程度，但是由于激光共聚焦圖像中損傷灶點顆粒大小，顆粒聚集程度與引起細胞DNA雙鏈斷裂損傷的復(fù)雜關(guān)系，使用定量計算和分析算法工具也各具特色，新型的算法識別系統(tǒng)也在開發(fā)應(yīng)用，所以選擇合適準確的定量計算方法和分析工具，以及同時輔助應(yīng)用其他的DNA雙鏈斷裂損傷測定方法，有利于提高分析計算結(jié)果的準確率.