稻瘟病菌Fbox蛋白MoFbr7生物學(xué)功能分析

張夢園 潘銳 譚樂勇 郭敏

摘要Fbox蛋白在泛素蛋白酶體途徑（ubiquitinproteasome pathway，UPP）中參與調(diào)控胞內(nèi)蛋白降解、受體識別、信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程。本研究從稻瘟病菌中克隆了Fbox基因MoFbr7，序列分析表明，該基因編碼產(chǎn)物具有1個Fbox結(jié)構(gòu)域（N端）和8個連續(xù)的WD40重復(fù)序列（C端），在絲狀真菌中高度保守。利用基因敲除方法，獲得4個MoFbr7基因敲除突變體，同時構(gòu)建了回補(bǔ)菌株。表型分析結(jié)果顯示，MoFbr7基因缺失突變體在產(chǎn)孢量、附著胞形態(tài)、原生質(zhì)體釋放、致病性等方面均無異常。突變體在MM、RDC培養(yǎng)基上生長速率下降;對細(xì)胞壁脅迫因子CFW（Calcofluor white）、剛果紅敏感。以上結(jié)果表明MoFbr7參與稻瘟病菌的營養(yǎng)生長與細(xì)胞壁完整性，為進(jìn)一步揭示其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞稻瘟病菌;Fbox蛋白;基因敲除;功能分析

中圖分類號：S 435.111.41

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018135

稻瘟病菌Magnaporthe oryzae是引起稻瘟病的病原菌，對全球水稻產(chǎn)量及品質(zhì)造成嚴(yán)重威脅[1]。十幾年來，世界各國科學(xué)家已對稻瘟病菌進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究，為稻瘟病菌作為分子生物學(xué)模式生物研究植物病原真菌致病機(jī)理打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[23]。

Fbox蛋白廣泛存在于真核生物中，在細(xì)菌和藍(lán)藻中也有發(fā)現(xiàn)[4]。該蛋白最先在人體中被發(fā)現(xiàn)并被鑒定為泛素連接酶復(fù)合物（Skp1Cullin1Fbox，SCF）的底物識別亞基[5]，在泛素蛋白酶體途徑中不可或缺[6]。有研究表明，SCF復(fù)合體可以在植物中合成，可能控制多種代謝途徑中涉及的數(shù)百個底物的穩(wěn)定性[7]。另外，F(xiàn)box蛋白在不同物種中數(shù)量差距懸殊。全基因組重復(fù)（whole genome duplication，WGD）可大大增加Fbox基因的數(shù)量?；騺G失在WGD后迅速發(fā)生[8]，不同物種的不同基因丟失率也會導(dǎo)致Fbox基因數(shù)量波動[9]，還有一些植物可能傾向于消除冗余基因，確保在特定環(huán)境條件下生存[10]。Fbox蛋白不僅含有Fbox基序，還包括其他結(jié)構(gòu)域[11]，如WD40（tryptophan aspartic acid 40）重復(fù)域、富含亮氨酸的重復(fù)域（leucinerich repeat，LRR）、FBD結(jié)構(gòu)域（FBox and BRCT domain）、PAS 結(jié)構(gòu)域（Per Arnt Sim）、PPR結(jié)構(gòu)域（pentatricopeptide repeat）、TUB結(jié)構(gòu)域（tubby）、Kelch 結(jié)構(gòu)域（Kelch repeats）[12]和環(huán)指結(jié)構(gòu)域（really interesting new gene，RING finger）等。

近年來，在真核生物中，已經(jīng)鑒定出許多Fbox基因與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞器的發(fā)生、DNA的轉(zhuǎn)錄和修復(fù)、核糖體的合成等生命活動密切相關(guān)[1314]。有研究表明，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中的Grr1在細(xì)胞周期中不可或缺[15]。為探究Grr1在稻瘟病菌中的同源物是否也具有類似功能，本文對稻瘟病菌中同源物MoFbr7且含有Fbox結(jié)構(gòu)域的基因進(jìn)行初步功能分析，有助于了解MoFbr7對稻瘟病菌的調(diào)控機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

稻瘟病菌野生型菌株 Guy11、酵母菌株FY834、大腸桿菌Escherichia coli菌株DH5α、農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105均由本研究室保存。MoFbr7敲除及回補(bǔ)菌株在本研究中獲得，采用濾紙片法保存于-20℃。

水稻感病品種‘CO39和大麥品種‘Golden Promise均保存于本真菌研究室。

1.2MoFbr7蛋白序列的獲得與分析

在數(shù)據(jù)庫（https：∥genome.jgi.doe.gov/programs/fungi/index.jsf）中獲得釀酒酵母菌中Grr1的氨基酸序列，然后在稻瘟病菌中進(jìn)行Blastp分析，找到22個同源基因。本文將其中一個含有Fbox結(jié)構(gòu)域的基因MGG_06372.6（Fbox/WD repeatcontaining protein 7）命名為MoFbr7，并對其序列保守性進(jìn)行了分析。對數(shù)據(jù)庫中獲取的MoFbr7氨基酸序列，利用SMART工具對其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。于NCBI網(wǎng)站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中使用Blastp搜索工具獲得其他同源物序列。用BioEdit和MEGA 7.0軟件對MoFbr7和其他序列進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3MoFbr7基因敲除及回補(bǔ)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

根據(jù)數(shù)據(jù)庫提供的基因組序列，以稻瘟病菌菌株Guy11的基因組DNA為模板，使用GL547（F）/GL548（R）和GL549（F）/GL550（R）分別擴(kuò)增MoFbr7上下游各1.0 kb左右的片段。將上下游片段與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPH）片段混合，利用酵母同源重組的方法整合到經(jīng)SalⅠ酶切的ps110載體上，從而獲得敲除載體ps110：：MoFbr7：：HPH。

設(shè)計(jì)引物GL1168（F）/GL1169（R）擴(kuò)增包括MoFbr7基因的全長片段，連接至ps1102載體（含有萎銹靈抗性基因CBX）上，構(gòu)建成為回補(bǔ)載體ps1102：：MoFbr7c：：CBX。通過農(nóng)桿菌的方式將ps110：：MoFbr7：：HPH整合于Guy11菌株，并使用200 μg/mL潮霉素篩選;將ps1102：：MoFbr7c：：CBX整合于ΔMoFbr7并使用50 μg/mL CBX抗性篩選。所用引物序列見表1。

1.4MoFbr7基因敲除及回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的鑒定

提取所有轉(zhuǎn)化子基因組，用上游臂外引物和HPH片段上引物GL1381（F）/GL557（R）進(jìn)行PCR檢測，可擴(kuò)增出1 993 bp條帶，且用下游臂外引物和HPH上引物GL558 （F）/GL1382（R）可擴(kuò)增出2 264 bp條帶的轉(zhuǎn)化子為待定的敲除突變體。提取所有待定轉(zhuǎn)化子及野生型總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。進(jìn)一步利用GL1460 （F）/GL1461（R）對其進(jìn)行RTPCR分析檢測，不能得到555 bp產(chǎn)物的菌株，則為敲除突變體;回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子中得到555 bp產(chǎn)物的則為回補(bǔ)菌株，以Actin擴(kuò)增結(jié)果為對照。所用引物序列見表1。

1.5MoFbr7突變體的表型分析

1.5.1營養(yǎng)生長

從ΔMoFbr7、MoFbr7c及Guy11菌落邊緣切取邊長為2 mm的正方形菌塊，分別接種于CM（complete medium）、OM（oatmeal medium）、MM（minimal medium）及RDC（rice medium）培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)，7 d后觀察菌落生長形態(tài)并測量直徑。

1.5.2產(chǎn)孢

從ΔMoFbr7、MoFbr7c及Guy11菌株菌落邊緣切取菌塊，接種于RDC產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)6 d，轉(zhuǎn)于40 W 黑光燈下誘導(dǎo)產(chǎn)孢，3 d后，分別用4 mL滅菌水洗滌供試菌株，收集分生孢子，并在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)與數(shù)量。

1.5.3附著胞形成

分別收集各個菌株的孢子并將濃度稀釋為5×104個/mL。滴于疏水玻片以監(jiān)測附著胞的發(fā)生，25℃避光培養(yǎng)。分別于2、4、8、12、24 h 顯微鏡下監(jiān)測附著胞發(fā)生情況。

1.5.4大麥侵染測定

剪取大麥葉片，背面朝上貼于保濕盒，分別收集各個菌株的孢子并將濃度稀釋為2×104個/mL，于24、36、48 h統(tǒng)計(jì)附著胞侵入情況。

1.5.5致病力檢測

分別將ΔMoFbr7、MoFbr7c及Guy11菌株的孢子濃度稀釋為5×104個/mL，利用噴霧器將其噴灑于14 d水稻葉片上。28℃暗培養(yǎng)24 h后進(jìn)行L∥D=12 h∥12 h光暗交替培養(yǎng)，7 d后觀察葉片發(fā)病情況并拍照。

1.5.6對脅迫因子的敏感性測定

從活化后的ΔMoFbr7、MoFbr7c及Guy11菌株的菌落邊緣切取菌塊，接種于含200 μg/mL Calcofluor white （CFW），200 μg/mL剛果紅（CR），0.7 mol/L NaCl，3 mmol/L H2O2、0.01% SDS、1.2 mol/L山梨醇及無藥劑的CM平板中，置于28℃，黑暗培養(yǎng)。5 d后拍攝菌落生長情況并測量菌落直徑，計(jì)算抑制率。

1.5.7原生質(zhì)體釋放觀察

切取ΔMoFbr7、MoFbr7c及野生型菌株邊緣菌塊于CM液體培養(yǎng)基中，28℃，165 r/min液體培養(yǎng)，2 d后過濾并壓干水分，各稱取100 mg菌絲體，分別置于濃度為7.5 mg/mL的10 mL Lysing enzyme酶解液中，每隔0.5 h，用血球計(jì)數(shù)板監(jiān)測原生質(zhì)體釋放量，共計(jì)3個時間段。

2結(jié)果與分析

2.1MoFbr7生物信息學(xué)分析

于SMART網(wǎng)站中預(yù)測MoFbr7的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)在其N端（第142至183位）存在一個典型的Fbox結(jié)構(gòu)域，同時在其C端（第272至592位）存在8個連續(xù)的WD40序列（圖1），說明這是一個典型的Fbox基因。同源蛋白比對發(fā)現(xiàn)，MoFbr7與炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、球孢白僵菌Beauveria bassiana的同源性高達(dá)77%、75%、73%，而與人類Homo sapiens的同源性僅為28%（圖2）。以上表明，MoFbr7蛋白在絲狀真菌中具有較高保守性。

2.2基因敲除及回補(bǔ)突變體的獲得

構(gòu)建MoFbr7基因敲除盒（圖3），PCR驗(yàn)證MoFbr7敲除及回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子ΔMoFbr71、ΔMoFbr73、ΔMoFbr74和ΔMoFbr75分別由GL1381（F）/GL557（R）擴(kuò)增得到1 993 bp的條帶;由GL1382（F）/GL558（R）擴(kuò)增得到2 264 bp的條帶;進(jìn)一步RTPCR分析檢測，使用內(nèi)引物GL1460（F）/GL1461（R）不能夠在敲除突變體中擴(kuò)增出555 bp的條帶，而在MoFbr7c中能擴(kuò)增出555 bp條帶（圖3），說明成功獲得了4個具潮霉素抗性的基因功能缺失轉(zhuǎn)化子ΔMoFbr71、ΔMoFbr73、ΔMoFbr74和ΔMoFbr75和1個基因回補(bǔ)菌株MoFbr7c。

2.3MoFbr7表型鑒定

2.3.1營養(yǎng)生長

ΔMoFbr7在CM、OM平板上的生長速率正常;但在MM和RDC平板上，ΔMoFbr7菌株生長速率分別降低7.58%和10.38%（圖4），說明ΔMoFbr7參與調(diào)控稻瘟病菌對部分營養(yǎng)物質(zhì)的利用。

2.3.2產(chǎn)孢量

在RDC培養(yǎng)條件下，進(jìn)一步分析ΔMoFbr7的產(chǎn)孢情況。結(jié)果顯示，ΔMoFbr7分生孢子形態(tài)沒有異常（圖5a），附著胞形態(tài)也與野生型菌株一致（圖5b）。另外，ΔMoFbr7的孢子形成量也未受到影響（圖5c）。表明MoFbr7與分生孢子的形成及附著胞發(fā)育沒有重要關(guān)系。

2.3.3突變體分生孢子對大麥表皮的侵染

于24 h時撕取處理過的大麥表皮，發(fā)現(xiàn)ΔMoFbr7的侵入栓形成沒有異常。36 h后發(fā)現(xiàn)突變體成功侵入到表皮細(xì)胞內(nèi)并分化形成侵染菌絲，侵入率與野生型相當(dāng)，且菌絲分化程度也與野生型基本一致（圖6a），48 h時ΔMoFbr7菌絲能正常擴(kuò)展數(shù)據(jù)未展示。表明MoFbr7在侵染過程中不起關(guān)鍵作用。

2.3.4致病性

進(jìn)一步將收集的ΔMoFbr7孢子噴灑于水稻葉片，7 d后觀察到所有葉片上產(chǎn)生典型病斑，數(shù)目與形態(tài)皆與野生型無區(qū)別（圖6b）?？梢?，MoFbr7基因與其對水稻的毒力不相關(guān)。

2.3.5對脅迫因子的敏感性及原生質(zhì)體釋放

在補(bǔ)充了各種類型脅迫因子的CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)MoFbr7突變體和Guy11菌株，評估MoFbr7突變體對滲透壓和氧化應(yīng)激的敏感性。結(jié)果顯示，在含有CFW和CR的培養(yǎng)基上，ΔMoFbr7抑制率較野生型分別高12.3%和10.5%（圖7a～b）。結(jié)果表明，MoFbr7基因的缺失可能使稻瘟病菌的細(xì)胞壁組分發(fā)生變化。進(jìn)一步原生質(zhì)體釋放觀察顯示，突變體的原生質(zhì)體釋放量與野生型無異（圖7c）。

3小結(jié)與討論

釀酒酵母中Grr1參與細(xì)胞對營養(yǎng)的攝取，并且影響蛋白降解，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞周期[15]。本研究室在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌中Mofbox參與營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢、附著胞形成，同時影響對寄主的毒力[16]。Mogrr1影響菌株的生長速率、黑色素沉著、分生孢子梗的形成、對外源脅迫因子耐受性及對水稻的毒力[17]。

本研究對一個新的Fbox基因MoFbr7進(jìn)行鑒定，該基因的生物信息學(xué)結(jié)果表明，其編碼產(chǎn)物具有1個典型的Fbox結(jié)構(gòu)域和8個連續(xù)的WD40結(jié)構(gòu)域，并在絲狀真菌中具有高度保守性。作為Fbox蛋白的一種，WD40蛋白被鑒定涉及細(xì)胞周期中的多種功能。在稻瘟病菌中，WD40重復(fù)蛋白MoCreC影響碳分解代謝阻抑（carbon catabolite repression，CCR）并且涉及稻瘟病菌的分生孢子、生長和致病性[18]。因此，MoFbr7基因具有參與調(diào)控對寄主毒力的可能性。

進(jìn)一步表型分析結(jié)果表明，稻瘟病菌MoFbr7突變體在產(chǎn)孢量、分生孢子形成及對寄主致病性與野生型菌株沒有顯著差異，這可能來源于基因功能冗余的原因。突變體在CM和OM培養(yǎng)基中與野生型無顯著差異，而MM培養(yǎng)基及RDC培養(yǎng)基中呈現(xiàn)菌絲生長速率下降，說明MoFbr7可能參與稻瘟病菌營養(yǎng)生長且對部分營養(yǎng)物質(zhì)的利用與釀酒酵母中Grr1參與營養(yǎng)物質(zhì)攝取這一結(jié)果相吻合。此外，ΔMoFbr7對細(xì)胞壁脅迫因子敏感，表明MoFbr7敲除突變體細(xì)胞壁組分可能發(fā)生變化。但是細(xì)胞壁的變化并沒有影響ΔMoFbr7在裂解酶處理下的原生質(zhì)體釋放量，說明這種變化可能只是微弱的，對細(xì)胞壁完整性的影響不大。在玉米黑粉菌Ustilago maydis中，pmt4和Kre2被發(fā)現(xiàn)對細(xì)胞壁脅迫因子敏感，但致病性分析顯示，僅有pmt4參與發(fā)病[19]。由此可見，輕微的細(xì)胞壁完整性改變并不是致病的關(guān)鍵因子，這可能是MoFbr7對CFW和CR敏感但最終不致病的原因。

綜上所述，本文通過基因敲除方法對MoFbr7的生物學(xué)功能進(jìn)行分析，對于其參與菌絲生長發(fā)育、調(diào)控細(xì)胞壁完整性及其他信號通路的分子機(jī)制，還待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：田喆）