蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性

劉娟 馮浩 王帥 高小寧 黃麗麗

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摘要為了明確蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性現(xiàn)狀，本研究采用菌絲生長速率法測定了來自7個(gè)省份7個(gè)不同年份的106株蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性，并建立了敏感基線。結(jié)果表明：供試蘋果樹腐爛病菌菌株的EC50區(qū)間在0.003～0.123 μg/mL，敏感性頻率分布呈連續(xù)性單峰曲線。經(jīng)KS法檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，未出現(xiàn)敏感性明顯下降的抗性群體，平均EC50 （0.044±0.029） μg/mL可作為蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感基線。不同地理來源的菌株對苯醚甲環(huán)唑的敏感性有顯著性差異，來自遼寧省的菌株敏感性最高，河南省的敏感性最低;不同年份的菌株敏感性也有顯著性差異，2009年采集的菌株對苯醚甲環(huán)唑的敏感性最高，2016年采集的菌株敏感性最低，菌株對藥劑的敏感性隨年份的推移逐漸降低，說明病菌的抗藥性不斷增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞蘋果黑腐皮殼菌;菌落直徑;苯醚甲環(huán)唑;EC50;抗藥性

中圖分類號：S 436.611.11

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018119

蘋果樹腐爛病（apple Valsa canker）是由蘋果黑腐皮殼屬真菌Valsa mali侵染引起的枝干病害[1]。該病的發(fā)生會造成樹皮組織腐爛，樹勢削弱，甚至枝枯樹死，果樹壽命縮短[2]。因其侵染途徑多樣、潛伏性強(qiáng)、致病機(jī)理復(fù)雜，病害防控困難，治愈率低，被稱為“蘋果的癌癥”[3]。

目前，生產(chǎn)上蘋果樹腐爛病主要依靠刮除病疤后涂抹藥劑或全樹噴淋藥劑等措施進(jìn)行防治，所用藥劑種類繁多[45]?；瘜W(xué)藥劑因其操作簡單，使用方便且見效快而成為防治蘋果樹腐爛病的主要藥劑。其中甲基硫菌靈可以高效預(yù)防腐爛病菌的侵染[6]，丁香菌酯能有效抑制蘋果樹腐爛病病疤的復(fù)發(fā)[7]，戊唑醇能有效抑制蘋果樹腐爛病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長[8]。而三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑雖然尚未在蘋果樹腐爛病上登記使用，但是其對腐爛病菌室內(nèi)效果要強(qiáng)于同類殺菌劑戊唑醇[8]，可以作為防治蘋果樹腐爛病的替代藥劑。

苯醚甲環(huán)唑由先正達(dá)公司于1989年研發(fā)上市，具有高效、廣譜、低毒的特點(diǎn)，對子囊菌門和擔(dān)子菌門的病菌有很好的防治效果[9]。其作用機(jī)制是抑制真菌細(xì)胞膜上的麥角甾醇合成，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成功能紊亂，從而達(dá)到殺菌的目的[1011]。由于該藥劑作用位點(diǎn)單一，長期反復(fù)使用會引起病菌產(chǎn)生抗藥性[12]，被認(rèn)為是一種具有中等抗性風(fēng)險(xiǎn)的殺菌劑。蘋果黑星病菌Venturia inaequalis、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum對該藥劑已經(jīng)產(chǎn)生了抗性[1314]。近年來，我國各地蘋果產(chǎn)業(yè)區(qū)普遍應(yīng)用苯醚甲環(huán)唑等三唑類殺菌劑防治各類真菌病害，是否有抗藥性菌株尚不明確。因此，本研究通過測定采自全國的106株蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性，并比較不同地理來源、不同年份的菌株敏感性差異，以期明確蘋果樹腐爛病菌對該藥劑的敏感性現(xiàn)狀，為病害的科學(xué)防治和病菌的抗藥性監(jiān)測提供重要科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

本實(shí)驗(yàn)室自2007至2016年從陜西、山西和河南等省蘋果產(chǎn)區(qū)的田間發(fā)病植株采集分離了106株蘋果樹腐爛病菌，其中陜西省54株，山西省18株，新疆維吾爾自治區(qū)10株，河南省11株，遼寧省5株，山東省4株，四川省4株，用于敏感性測定。

1.1.2供試藥劑與濃度

95.6%苯醚甲環(huán)唑原藥，先正達(dá)公司提供;濃度設(shè)置為0.006 3、0.013、0.025、0.050、0.100和0.200 μg/mL。

1.2方法

1.2.1含藥培養(yǎng)基的制備

將苯醚甲環(huán)唑原藥溶于丙酮制成10 000 μg/mL母液，加入終濃度為0.2%的Tween80，置于4℃冰箱中備用。用蒸餾水稀釋母液，按設(shè)置濃度加入到PDA培養(yǎng)基中，充分混勻，配成不同質(zhì)量濃度的苯醚甲環(huán)唑含藥平板。

1.2.2敏感性測定

參考Yin等[15]的方法進(jìn)行。被測菌株于25℃條件下在PDA平板上培養(yǎng)72 h，利用打孔器自菌落邊緣打取大小相同、直徑為5 mm的菌餅，菌絲面朝下接種于含藥平板的中心。每個(gè)濃度重復(fù)3次，以不加藥的PDA平板作為對照。25℃下培養(yǎng)72 h，用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值，計(jì)算不同濃度的苯醚甲環(huán)唑?qū)z的生長抑制率。

菌絲生長抑制率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）]×100%。

以X（藥劑質(zhì)量濃度的對數(shù)值）和Y（抑制率對應(yīng)的幾率值）進(jìn)行回歸分析得到毒力回歸方程Y=a+bX以及相關(guān)系數(shù)r，并計(jì)算EC50。

1.2.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS 16.0進(jìn)行處理。對EC50進(jìn)行KolmogorovSmirnov正態(tài)性檢驗(yàn)，參照祁之秋等的方法[16]獲得蘋果樹腐爛病菌群體對苯醚甲環(huán)唑的敏感性頻率分布圖，建立對苯醚甲環(huán)唑的敏感基線。采用Duncan氏新復(fù)極差法對不同地區(qū)、不同年份的平均EC50進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感基線的建立

檢測發(fā)現(xiàn)，苯醚甲環(huán)唑?qū)碜?個(gè)省的106株蘋果樹腐爛菌的EC50分布在0.003～0.123 μg/mL，平均值為（0.044±0.029）μg/mL。所檢測的菌株對該藥劑具有較高的敏感性，未發(fā)現(xiàn)抗藥性亞群體。但最大值為最小值的41倍，EC50跨度范圍比較大，表明群體內(nèi)個(gè)體間對苯醚甲環(huán)唑的敏感性差異較大。

將本研究得到的EC50分成6個(gè)區(qū)間，每個(gè)區(qū)間出現(xiàn)的菌株頻率如圖1所示，EC50敏感性頻率呈現(xiàn)連續(xù)性單峰曲線分布，通過SPSS中的KS正態(tài)檢驗(yàn)得到P=0.135>0.05，說明菌株對苯醚甲環(huán)唑的敏感性頻率符合正態(tài)分布，按照野生病原群體對藥劑的敏感性呈正態(tài)分布的原理，本研究中106株病菌的平均EC50（0.044 μg/mL±0.029 μg/mL）可作為蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感基線。

2.2不同地理來源的菌株對苯醚甲環(huán)唑的敏感性水平

不同地理來源的蘋果樹腐爛病菌菌株對苯醚甲環(huán)唑的敏感性存在一定的差異（表1），最敏感的是遼寧菌株，其EC50平均值為（0.020 0±0.008 8）μg/mL，最不敏感的是河南菌株，其EC50平均值為（0.059 6±0.023 6）μg/mL。山西、新疆、河南的菌株群體內(nèi)部個(gè)體對苯醚甲環(huán)唑的敏感性差異較大。遼寧地區(qū)的菌株同河南、山東和新疆3個(gè)地區(qū)的菌株在P=0.05水平上差異顯著，其他地區(qū)的菌株對苯醚甲環(huán)唑的敏感性無顯著差異。

2.3不同年份的蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性水平

如表2所示，采自不同年份的蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性存在一定差異。2009年采集的菌株對苯醚甲環(huán)唑的敏感性最高，2016年菌株的敏感性最低，隨著年份推移病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性逐漸減弱。

3討論

殺菌劑用于防治某種植物病害之前，建立其敏感基線有助于優(yōu)化該殺菌劑的使用策略[17]。雖然苯醚甲環(huán)唑已經(jīng)在生產(chǎn)上應(yīng)用多年，但蘋果樹腐爛病菌對其敏感性水平尚不明確。本研究共檢測了采自中國7個(gè)省份的106株蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性。研究結(jié)果表明中國蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑還處于野生敏感種群階段，可將苯醚甲環(huán)唑?qū)┰嚲甑腅C50平均值（0.044±0.029）μg/mL作為中國蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感基線。該敏感基線可用于監(jiān)測田間蘋果樹腐爛病菌群體對苯醚甲環(huán)唑敏感性的變化，為評價(jià)其抗藥性風(fēng)險(xiǎn)和未來制定抗藥性治理策略提供參考。

本研究發(fā)現(xiàn)蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性差異與地理位置有關(guān)，這可能與不同地區(qū)的蘋果種植年限和面積、氣候環(huán)境條件、腐爛病的發(fā)生歷史，用藥措施以及病菌本身的遺傳差異及群體組成等因素有關(guān)[18]。此外，隨著時(shí)間的推移，蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性逐漸減弱，可能是由于生產(chǎn)中連續(xù)大量使用同類殺菌劑或者其他有交互抗性的殺菌劑，使得病菌對殺菌劑的敏感性發(fā)生了改變。為了延緩蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑抗藥性的產(chǎn)生，建議在田間通過輪換使用不同作用機(jī)制的藥劑，使蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性處于低抗性頻率階段，以延長農(nóng)藥的使用壽命。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）