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    蘇云金芽胞桿菌cry8Ea啟動子區(qū)orf1片段缺失增強(qiáng)啟動子活性

    2019-06-11 11:55崔婷婷杜立新彭琦
    植物保護(hù) 2019年1期

    崔婷婷 杜立新 彭琦

    摘要本文分別構(gòu)建了cry8E基因上游的啟動子(Porf18E)和其上游缺失orf1基因的啟動子(PΔorf18E)融合lacZ基因的表達(dá)載體,通過β半乳糖苷酶活性的分析,發(fā)現(xiàn)PΔorf18E的轉(zhuǎn)錄活性高于Porf18E。分別用PΔorf18E和Porf18E指導(dǎo)cry1Ac基因的表達(dá),通過光學(xué)顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)兩個啟動子指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白均可形成雙錐形晶體;通過總蛋白定量分析發(fā)現(xiàn),缺失orf1基因的啟動子(PΔorf18E)指導(dǎo)的Cry1Ac蛋白表達(dá)量高于Porf18E啟動子指導(dǎo)的Cry1Ac蛋白表達(dá)量;生物活性測定表明:PΔorf18E指導(dǎo)的Cry1Ac晶體蛋白對小菜蛾P(guān)lutella xylostella具有殺蟲活性,高于Porf18E指導(dǎo)的Cry1Ac晶體蛋白對小菜蛾的殺蟲活性。本文獲得的強(qiáng)活性的啟動子PΔorf18E是目前已報道的轉(zhuǎn)錄活性最高的cry基因啟動子,該啟動子為Cry蛋白的表達(dá)和遺傳工程菌株構(gòu)建提供了重要元件。

    關(guān)鍵詞蘇云金芽胞桿菌;cry基因啟動子;轉(zhuǎn)錄活性;Cry晶體蛋白;晶體蛋白表達(dá)

    中圖分類號:S 476.11

    文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    DOI:10.16688/j.zwbh.2018138

    蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis,簡稱Bt,是革蘭氏陽性細(xì)菌,屬于蠟樣芽胞桿菌菌族Bacillus cereus group,其在芽胞形成的同時能夠產(chǎn)生對多種農(nóng)林害蟲有殺蟲活性的伴胞晶體,主要由cry或cyt基因編碼。因其對人畜無害、對環(huán)境友好等特性,Bt已被商業(yè)化應(yīng)用,成為世界上應(yīng)用最廣的微生物殺蟲劑[1]。但是Bt殺蟲劑在田間應(yīng)用過程中,Cry蛋白存在持效期短、受紫外照射等環(huán)境因素影響容易降解等缺點(diǎn),因此提高Cry蛋白的產(chǎn)量和穩(wěn)定性成為Bt遺傳改良的有效策略。目前已報道,cry8E基因的啟動子指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白產(chǎn)量高于野生菌株HD73產(chǎn)生的Cry1Ac蛋白[2]。高活性的非cry基因的啟動子也已成功表達(dá)Cry蛋白,如編碼芽胞外壁基層蛋白的exsY基因的啟動子PexsY可正確指導(dǎo)Cry1Ac蛋白的表達(dá)[3];最新的研究表明,Bt HD73_5014基因的啟動子可以高效地指導(dǎo)表達(dá)Cry1Ac蛋白,其表達(dá)的蛋白產(chǎn)量與cry8E啟動子指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白產(chǎn)量相當(dāng)[4]。因此,發(fā)掘強(qiáng)活性的啟動子指導(dǎo)Cry蛋白的表達(dá)是一條重要途徑。

    cry8E基因和上游基因orf1以操縱子形式成為一個轉(zhuǎn)錄單元,分別受σH和σE調(diào)控[5],cry8E基因的啟動子Porf1cry8E是目前報道的轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)的cry基因啟動子[4,6]。本研究在此基礎(chǔ)上,分析了缺失orf1基因的啟動子PΔorf18E的活性;用PΔorf18E啟動子指導(dǎo)表達(dá)Cry1Ac晶體蛋白并檢測其殺蟲活性。PΔorf18E啟動子為Cry蛋白的表達(dá)和遺傳工程菌株構(gòu)建提供了重要元件。

    1材料和方法

    1.1材料

    1.1.1菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

    本試驗中所用菌株與質(zhì)粒見表1。大腸桿菌Escherichia coli的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨1.0%,酵母提取物0.5%,NaCl 1.0%,pH 7.2)。Bt的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基和SSM培養(yǎng)基[7]。Bt在30℃、220 r/min條件下培養(yǎng);E. coli在37℃、220 r/min條件下培養(yǎng),氨芐青霉素使用終濃度為100 μg/mL,紅霉素使用終濃度為5 μg/mL。

    1.1.2主要試劑

    TaqMix DNA聚合酶購自BioMed;限制性內(nèi)切酶、PrimeStar、T4 DNA連接酶、DH5α感受態(tài)、Solution I購自大連寶生物有限公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Axygen;無縫克隆試劑盒(Seamless Assembly Cloning Kit)購自中美泰和生物技術(shù)有限公司。

    1.1.3引物合成及序列測定

    根據(jù)Bt 185菌株[8]和HD73菌株[10]的基因組序列設(shè)計引物,引物合成由上海生工生物工程公司北京合成部完成,引物名稱及序列見表2。序列測定由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

    1) 下劃線表示酶切位點(diǎn)。

    Restriction enzyme sites are underlined.

    1.2Porf18E和PΔorf18E啟動子融合lacZ基因表達(dá)載體的構(gòu)建

    以Bt185基因組[8]為模板,以Porf15/P8E3為引物擴(kuò)增含有orf1的啟動子、orf1基因和cry8E基因啟動子的片段Porf18E(1 352 bp),PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)PstⅠ和BamHⅠ雙酶切并連接至含有l(wèi)acZ報告基因的pHT30418Z載體Pst Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切片段上,轉(zhuǎn)化E. coli TG1菌株,獲得重組質(zhì)粒pHTPorf18E;以Bt185基因組為模板,分別以Porf15/Porf13和P8E5/P8E3為引物擴(kuò)增orf1的啟動子(Porf1,559 bp)和cry8E基因的啟動子(Pcry8E,280 bp),PCR產(chǎn)物純化后,應(yīng)用無縫克隆試劑盒將Porf1和Pcry8E片段連接至含有l(wèi)acZ報告基因的pHT30418Z載體Pst Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切片段上,轉(zhuǎn)化E. coli TG1菌株,獲得缺失orf1基因的重組質(zhì)粒pHTPΔorf18E。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定,轉(zhuǎn)化至E. coli ET菌株使質(zhì)粒去甲基化,然后將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至Bt HD73菌株,獲得菌株HD(Porf18E18Z)和HD(PΔorf18E18Z)。

    1.3β半乳糖苷酶活性分析

    分別取500 μL活化過夜的HD(Porf18E18Z)和HD(PΔorf18E18Z)菌株轉(zhuǎn)接到50 mL SSM培養(yǎng)基中,30℃,220 r/min培養(yǎng)至T0時期(T0為對數(shù)生長期結(jié)束時間,Tn為T0后第n小時),每隔1 h取樣1次,每次2 mL,12 000 r/min離心,棄上清,沉淀于-40℃保存?zhèn)溆?。β半乳糖苷酶活性測定方法參考文獻(xiàn)[11],試驗至少重復(fù)3次。

    1.4Porf18E和PΔorf18E啟動子指導(dǎo)Cry1Ac表達(dá)載體的構(gòu)建

    分別以pHTPorf18E和pHTPΔorf18E質(zhì)粒為模板,以Porf15/P8E3為引物,擴(kuò)增Porf18E和PΔorf18E片段;以BtHD73基因組為模板,以1ACF和1ACR為引物擴(kuò)增cry1Ac基因(3 537 bp),PCR產(chǎn)物純化后,應(yīng)用無縫克隆試劑盒,分別將Porf18E和cry1Ac兩個片段、PΔorf18E和cry1Ac兩個片段連接至經(jīng)過Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切的pHT304載體上,轉(zhuǎn)化E. coli TG1菌株,獲得重組質(zhì)粒pHTPorf18E1Ac和pHTPΔorf18E1Ac。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定,轉(zhuǎn)化至E. coli ET菌株使質(zhì)粒去甲基化,然后將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至Bt HD73-無晶體突變菌株中,獲得菌株HD-(Porf18E1Ac)和HD-(PΔorf18E1Ac)。

    1.5顯微鏡觀察

    分別取500 μL過夜活化的HD-(Porf18E1Ac)和HD-(PΔorf18E1Ac)菌液轉(zhuǎn)接至50 mL SSM培養(yǎng)基,30℃,220 r/min,培養(yǎng)至T20、T22和T24,取1 mL菌液,12 000 r/min離心1 min,棄上清,沉淀用1 mL的無菌水清洗1次,12 000 r/min離心1 min,棄上清,沉淀用60 μL的水懸浮,吸取1 μL的樣品置于載玻片上,上面覆蓋蓋玻片在100×的油鏡(OLYMPUS,BX61)下觀察菌體形態(tài)。

    1.6菌體總蛋白定量

    分別取500 μL過夜活化的HD-(Porf18E1Ac)和HD-(PΔorf18E1Ac)菌液轉(zhuǎn)接至50 mL SSM培養(yǎng)基,30℃,220 r/min,培養(yǎng)到細(xì)胞裂解(T24),12 000 r/min離心1 min收集菌體,用水重懸,加入石英砂破碎,混合均勻;樣品與5 ×loading buffer混勻,沸水浴中10 min,12 000 r/min離心10 min,取上清用 Pierce660 nm Protein Assay Kit 進(jìn)行總蛋白的定量,方法參見Pierce 660 nm Protein Assay Kit 說明書。取總蛋白量一致的樣品SDSPAGE(sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis)檢測Cry1Ac蛋白,并利用Image J軟件分析Cry1Ac蛋白的表達(dá)量[2]。

    1.7生物活性測定

    以小菜蛾P(guān)lutella xylostella為試蟲,用于生物活性測定的菌株為HD-(Porf18E1Ac)、HD-(PΔorf18E1Ac)、HD73和HD73-。菌株在SSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至T24時期,將菌液凍干,取相同生物量的4株菌的凍干粉,用滅菌水稀釋成相同的濃度,分別為:1.25、2.5、5、10、20、40和80 μg/mL;將上述不同濃度的菌液均勻地涂抹于直徑為6 cm的卷心菜葉上,晾干后,置于9 cm的培養(yǎng)皿中;每個培養(yǎng)皿中接種30頭體型相當(dāng)?shù)男〔硕?齡幼蟲。48 h后計算幼蟲成活率和LC50。數(shù)據(jù)獨(dú)立重復(fù)3次。

    2結(jié)果與分析

    2.1Porf18E和PΔorf18E啟動子活性分析

    cry8E基因上游的全長啟動子Porf18E和缺失orf1基因的啟動子PΔorf18E融合lacZ基因的表達(dá)菌株HD(Porf18E18Z)和HD(PΔorf18E18Z)的構(gòu)建流程見圖1a,β半乳糖苷酶活性測定表明,在T0-T3時期,HD(Porf18E18Z)和HD(PΔorf18E18Z)菌株的轉(zhuǎn)錄活性沒有明顯區(qū)別(圖1b),從T4開始到T12,HD(PΔorf18E18Z)菌株的活性明顯高于HD(Porf18E18Z)菌株,說明orf1基因的缺失導(dǎo)致cry8E基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性上升。

    2.2Porf18E和PΔorf18E指導(dǎo)Cry1Ac表達(dá)菌株的獲得

    缺失orf1基因的啟動子轉(zhuǎn)錄活性PΔorf18E高于全長的Porf18E啟動子轉(zhuǎn)錄活性,為了比較兩個啟動子指導(dǎo)的Cry蛋白的表達(dá)量,構(gòu)建了Porf18E和PΔorf18E指導(dǎo)Cry1Ac表達(dá)載體(詳見方法1.4),構(gòu)建流程見圖2a,將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入HD73-無晶體突變體株,獲得用于表達(dá)Cry1Ac蛋白的菌株HD-(Porf18E1Ac)和HD-(PΔorf18E1Ac)。在cry1Ac基因內(nèi)部設(shè)計3′端引物(8E1AcR),在Porf1片段上游設(shè)計5′端引物(8E1AcR),經(jīng)PCR鑒定(圖2b),以HD-(Porf18E1Ac)菌株為模板,擴(kuò)增得到1 104 bp的片段;以HD-(PΔorf18E1Ac)菌株為模板,擴(kuò)增得到681 bp的片段,兩個PCR產(chǎn)物大小相差423 bp,與缺失的orf1基因的大小一致,說明菌株構(gòu)建正確。

    2.3Cry1Ac晶體形態(tài)學(xué)觀察

    在光學(xué)顯微鏡下觀察HD-(Porf18E1Ac)和HD-(PΔorf18E1Ac)菌株產(chǎn)生的Cry1Ac晶體蛋白形態(tài),以野生型HD73和無晶體突變株HD73-作為對照,結(jié)果(圖3)表明,在T20、T22、T24這3個時期,HD-(Porf18E1Ac)和HD-(PΔorf18E1Ac)菌株均可以正常表達(dá)Cry1Ac晶體蛋白,與野生型HD73一樣,形成雙錐形晶體蛋白,而HD73-菌株無晶體蛋白產(chǎn)生。說明Porf18E和PΔorf18E均可指導(dǎo)表達(dá)Cry1Ac蛋白。

    2.4菌體Cry1Ac晶體蛋白產(chǎn)量分析

    為了比較Porf18E和PΔorf18E指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白產(chǎn)量,以HD73為陽性對照,HD73-為陰性對照,應(yīng)用Pierce660 nm Protein Assay Kit對HD-(Porf18E1Ac)和HD-(PΔorf18E1Ac)菌株進(jìn)行總蛋白定量,取相同量的總蛋白進(jìn)行SDSPAGE檢測,結(jié)果表明(圖4),HD-(Porf18E1Ac)和HD-(PΔorf18E1Ac)菌株均可表達(dá)出約130 kD的Cry1Ac蛋白,而HD73-無晶體突變體無蛋白表達(dá);利用Image J軟件分析Cry1Ac蛋白的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)在總蛋白量相同的條件下,HD-(PΔorf18E1Ac)菌株表達(dá)的Cry1Ac的量約為HD-(Porf18E1Ac)菌株的1.5倍,這與PΔorf18E和Porf18E啟動子的酶活數(shù)據(jù)趨勢相一致(圖1b),說明強(qiáng)活性的PΔorf18E啟動子,指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白的產(chǎn)量也提高。

    2.5生物活性分析

    為了比較Porf18E和PΔorf18E指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白的活性,選取相同生物量的HD-(Porf18E1Ac)和HD-(PΔorf18E1Ac)菌株對小菜蛾P(guān)lutella xylostella幼蟲進(jìn)行生物活性測定,以HD73為陽性對照,HD73-為陰性對照。接種幼蟲48 h后計算成活率,并計算LC50,結(jié)果表明(表3)HD-(PΔorf18E1Ac)菌株對小菜蛾的殺蟲活性最高,說明缺失orf1基因的啟動子PΔorf18E指導(dǎo)表達(dá)Cry1Ac蛋白的菌株具有較高的殺蟲活性,這與啟動子酶活結(jié)果(圖1b)和Cry1Ac蛋白表達(dá)量結(jié)果(圖4)一致。

    3討論

    前期研究中,通過比較不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的cry1Ac、cry3A、cry4A和cry8E基因的啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性由高到低依次為:Pcry8E>P1Ac>Pcry4A>Pcry3A[2,6,12]。cry8E基因的啟動子Pcry8E可以正確地指導(dǎo)Cry1Ac的表達(dá),并且可以形成雙錐形晶體,同時對小菜蛾有殺蟲活性[2,12]。本研究發(fā)現(xiàn),缺失orf1基因的啟動子PΔorf18E的轉(zhuǎn)錄活性高于已報道的最高活性的cry基因啟動子Porf1cry8E,因此PΔorf18E啟動子是目前發(fā)現(xiàn)的最高活性的cry基因的啟動子。PΔorf18E可正確指導(dǎo)表達(dá)Cry1Ac蛋白,并具有殺蟲活性,該啟動子可用于構(gòu)建高效表達(dá)載體,從而實現(xiàn)殺蟲蛋白的高效表達(dá),在研制更為高效廣譜的蘇云金芽胞桿菌工程菌中發(fā)揮重要的作用。

    蘇云金芽胞桿菌在表達(dá)大量的殺蟲晶體蛋白的同時還表達(dá)一些小分子量蛋白質(zhì),它們自身不具有殺蟲活性,但可以影響某些殺蟲晶體蛋白的表達(dá)和晶體形成。這些cry基因通常與這些小分子量蛋白基因組成轉(zhuǎn)錄單元共同轉(zhuǎn)錄[13]。這些小分子量蛋白本身沒有殺蟲活性,不是伴胞晶體的主要成分,但對某些殺蟲晶體蛋白的正常表達(dá)或晶體形成有促進(jìn)作用,甚至是必需的,因此被稱為輔助蛋白(accessory protein)。目前已知的輔助蛋白主要有5個,即cry11Aa操縱子中的P19和P20[14];cry2Aa操縱子中的ORF1和ORF2[15];以及cry19A 轉(zhuǎn)錄單元下游orf2 編碼的60 kD蛋白(ORF260k)[13]。P19對cry11A基因的表達(dá)略有幫助;P20作為分子伴侶能夠促進(jìn)多種Bt殺蟲晶體蛋白的產(chǎn)量和/或晶體形成[16];而ORF1 對晶體蛋白產(chǎn)量或蛋白晶體化的影響尚不明確。ORF2和ORF260k蛋白對于Cry2A 和Cry19A的晶體形成是必需的[13,17]。此外,cry6Aa2基因下游的ORF2蛋白對其表達(dá)存在負(fù)調(diào)控作用,但作用機(jī)制尚不明確[18]。本研究中的cry8E操縱子中orf1基因編碼的ORF1氨基酸序列,與cry9Ec1基因操縱子中的ORF1相似性為66%;與cry9Ca1基因操縱子中的ORF1相似性為65%;與cry2A基因操縱子中的ORF1具有64%的相似性;與cry11A操縱子中的第一個orf—P19有40%的相似性;與Cry18A操縱子中ORF1具有39%的相似性。轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究表明,orf1基因缺失導(dǎo)致cry8E基因啟動子PΔorf18E的轉(zhuǎn)錄活性上升,同時可以提高Cry1Ac蛋白的表達(dá)量,這些結(jié)果與前人報道的關(guān)于輔助蛋白p19基因和orf1基因的功能是不同的,說明cry8E操縱子中的ORF1存在一種新的功能,可能對cry8E基因的轉(zhuǎn)錄存在調(diào)控功能,但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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    (責(zé)任編輯:田喆)

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