運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)鑒定茶園蜘蛛物種

邢樹文 孫延杰 朱慧 查廣才

摘要運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)， 對(duì)廣東潮州茶園蜘蛛物種進(jìn)行了分子鑒定。本研究利用基因測(cè)序技術(shù)獲取了鳳凰山區(qū)域茶園50種蜘蛛的74條線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I （mitochondrial cytochrome C oxidase subunit Ⅰ， COⅠ） 基因序列。使用鄰接法 （neighbor joining， NJ） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 運(yùn)用ABGD（automatic barcode gap discovery）軟件對(duì)蜘蛛樣本進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明： 鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果與ABGD軟件劃分結(jié)果以及形態(tài)分類鑒定結(jié)果相一致， 運(yùn)用DNA條形碼可以有效地對(duì)蜘蛛物種進(jìn)行分子鑒定。這對(duì)茶園蜘蛛疑難物種和新物種的鑒定具有重要意義， 在茶園蜘蛛物種多樣性的研究中也具有重要價(jià)值。由此表明， 基于COⅠ基因的DNA條形碼對(duì)于本研究中所涉及的蜘蛛物種的劃分具有較好的區(qū)分結(jié)果， 可以作為一種有效的工具在茶園蜘蛛物種鑒定中進(jìn)行應(yīng)用。

關(guān)鍵詞蜘蛛;分子鑒定;系統(tǒng)發(fā)育樹;ABGD

中圖分類號(hào)：Q 959.226.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018131

茶園病蟲害的生態(tài)防控是實(shí)現(xiàn)鳳凰單叢茶可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。蜘蛛是農(nóng)林業(yè)害蟲重要的捕食性天敵， 是調(diào)控蟲害的重要生態(tài)因子[1]。因此，深入研究保護(hù)茶區(qū)的蜘蛛物種多樣性至關(guān)重要。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類已有250多年的歷史，全世界蜘蛛已知近47 000種[1]，我國(guó)僅記錄蜘蛛4 282種[2]，還有大量的物種沒有發(fā)現(xiàn)。傳統(tǒng)蜘蛛分類的方法是依據(jù)蜘蛛身體外部形態(tài)及其生殖器結(jié)構(gòu)的差異區(qū)分物種， 但對(duì)于體形、大小、體色相似的蜘蛛物種， 或因區(qū)域環(huán)境變化引起的種內(nèi)個(gè)體差異， 及處于不同發(fā)育階段的幼蛛， 僅依靠形態(tài)特征難免會(huì)鑒定錯(cuò)誤[3]， 這也是傳統(tǒng)分類學(xué)鑒定物種受限的原因。自從加拿大科學(xué)家Hebert等[4]提出把DNA條形碼應(yīng)用到生物物種鑒定之后， DNA條形碼就成為了分類學(xué)研究的熱點(diǎn)， 尤其在動(dòng)物物種鑒定上發(fā)展迅猛。動(dòng)物線粒體基因重組率低， 進(jìn)化速率較快， 且大多數(shù)物種COⅠ基因可以使用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。 Hebert等利用一段658 bp標(biāo)準(zhǔn)化的COⅠ基因片段對(duì)動(dòng)物進(jìn)行DNA序列分析，并準(zhǔn)確地對(duì)動(dòng)物物種進(jìn)行了分子鑒定[5]。由此表明， 利用COⅠ基因片段對(duì)蜘蛛物種進(jìn)行分子鑒定具有一定的可行性。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)利用DNA條形碼進(jìn)行物種分類的研究起步較晚，對(duì)蜘蛛的分子鑒定研究也較少，如，王麗艷對(duì)環(huán)京津地區(qū)的平腹蛛科[6]、劉娜對(duì)我國(guó)西南地區(qū)狼蛛科和漏斗蛛科[7]、曹瀟巍對(duì)中國(guó)擬遁蛛屬[8]及何靜超等對(duì)河北小五臺(tái)山蟹蛛科[9]進(jìn)行了DNA條形碼的分類研究。因此，我國(guó)蜘蛛分類學(xué)家DNA條形碼序列基因庫的建設(shè)和完善還任重道遠(yuǎn)。蜘蛛分布廣， 適應(yīng)性強(qiáng)， 其形態(tài)與體型易受環(huán)境變化的影響，因此，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法對(duì)一些隱存種、相近種的雌雄配對(duì)， 以及對(duì)處于不同發(fā)育期的幼蛛的分類鑒定有一定困難， 而運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)可以解決傳統(tǒng)分類上存在的疑難問題。本研究選用分布于鳳凰山茶區(qū)的50種蜘蛛74個(gè)樣本作為試驗(yàn)材料， 利用線粒體COⅠ基因片段構(gòu)建基于分子數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育樹，探索了DNA條形碼技術(shù)對(duì)鳳凰山茶區(qū)蜘蛛物種鑒定的準(zhǔn)確性， 對(duì)明確鳳凰單叢茶區(qū)的蜘蛛資源及蜘蛛物種的多樣性具有重要意義。該成果將填補(bǔ)鳳凰山茶區(qū)蜘蛛分類學(xué)及其多樣性研究的學(xué)科空白， 同時(shí)對(duì)該茶區(qū)生境的保護(hù)與評(píng)價(jià)、蜘蛛資源在生物防治中的應(yīng)用等具有積極意義。

1材料與方法

1.1標(biāo)本采集及形態(tài)鑒定

本研究所用的蜘蛛樣本采集于潮州鳳凰山茶區(qū)不同海拔高度的茶園，包括鳳凰鎮(zhèn)橋頭村茶園（海拔360 m）、上春村茶園和芼嶺村茶園（海拔520 m）、叫水坑村茶園（海拔690 m）和天池茶園（海拔930 m）。本次測(cè)序使用了50種蜘蛛的74個(gè)樣本， 測(cè)序前使用形態(tài)學(xué)分類的方法對(duì)蜘蛛樣本進(jìn)行物種鑒定，蜘蛛分類結(jié)果如表1所示。

1.2DNA提取與PCR擴(kuò)增

DNA提取采用Sambrook等[10]和楊聰慧等[11]的方法， 利用Animal tissue Genomic DNA Kit提取蜘蛛總DNA，操作步驟依照試劑盒的操作說明進(jìn)行。提取的總DNA用瓊脂糖電泳檢測(cè)后置于-80℃冰箱保存、備用。采用Folmer等[12]的方法，使用通用引物L(fēng)CO1490（5′GGTCAA CAAATCATAAAGATATT GG3′）和HCO 2198（5′TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3′）對(duì)供試的74個(gè)蜘蛛樣本進(jìn)行線粒體COⅠ基因擴(kuò)增， 擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度約為680 bp。PCR擴(kuò)增體系[13]為25 μL： MasterMix 12.5 μL， LCO1490 （10 μmol/L）＼HCO 2198（10 μmol/L）各0.8 μL， ddH2O 8.9 μL， DNA模板2.0 μL。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min;35個(gè)循環(huán)，94℃預(yù)變性30 s，45℃退火40 s，72℃延伸1 min;-20℃保存。

1.3數(shù)據(jù)分析

1.3.1DNA序列的比對(duì)

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)， 上樣量為2 μL， 電壓100 V， 在UVP凝膠成像系統(tǒng)下觀察和拍照。擴(kuò)增結(jié)果良好（約700 bp有單一的亮帶）的PCR產(chǎn)物， 委托蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果以Chromas軟件判斷基因測(cè)序峰圖質(zhì)量， 人工校對(duì)堿基， 確定COⅠ基因片段序列的正確性，以DNASTAR 6.0軟件中的子程序SeqMan拼接雙向測(cè)序結(jié)果， FASTA格式輸出，采用Clustal X軟件[1314] 對(duì)最終校對(duì)確認(rèn)的DNA序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。

1.3.2系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與遺傳距離的計(jì)算

利用MEGA 6.0軟件， 采用雙參數(shù)模型（Kimura 2parameter， K2P）[16]計(jì)算各分類單元之間的種間遺傳距離，同時(shí)分析其序列的堿基組成情況及密碼子的使用率。畫出頻率分布直方圖， 進(jìn)行“barcoding gap”[17]分析。以盲蛛序列作為外群， 鄰接法（neighbor joining， NJ）構(gòu)建蜘蛛的系統(tǒng)發(fā)育樹， 并進(jìn)行內(nèi)部分支檢驗(yàn)與1 000次bootstrap檢驗(yàn)分析， 確定各支系的置信度。如果在進(jìn)化樹上同一個(gè)物種能聚成一個(gè)單系， 則認(rèn)為NJ分子系統(tǒng)發(fā)育樹能將此物種與其他物種區(qū)分開， 反之則不能區(qū)分開。

1.3.3ABGD的劃分

使用ABGD（automatic barcode gap discovery）軟件[18]， 基于遺傳距離劃分樣本， 劃分在同一組的樣本被認(rèn)定屬于同一物種。本試驗(yàn)將50種蜘蛛74個(gè)樣本的K2P遺傳距離矩陣在線提交到ABGD網(wǎng)站（http：∥wwwabi.snv.jussieu.fr/public/abgd/）， P（prior intraspecific divergence）設(shè)為0.001～0.1， 最小相對(duì)gap寬度值X（minimum relative gap width）為1.0， 然后將樣本劃分結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果比較對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1COⅠ基因堿基組成

利用MEGA 6.0軟件[15]對(duì)50種蜘蛛COⅠ基因的74條序列和1個(gè)外群2條序列進(jìn)行堿基組成分析， 結(jié)果見表2。T、C、A、G的平均含量分別為42.3%、13.1%、26%和18.7%，A+T含量為68.3%，有明顯的AT偏向性。蜘蛛COⅠ基因各位點(diǎn)堿基組成頻率及替換型式， 如表3所示。平均堿基相同位點(diǎn)為434個(gè)， 平均轉(zhuǎn)換數(shù)為39個(gè)， 平均顛換數(shù)為55個(gè)， 平均顛換與轉(zhuǎn)換比為0.72; 顛換主要以AT為主， 轉(zhuǎn)換主要以TC為主。

2.2基于P距離的堿基替換飽和性分析

DNA的堿基替換類型有轉(zhuǎn)換（transition， TS）和顛換（transversion， TV）兩種類型。本研究對(duì)50種蜘蛛74個(gè)樣本進(jìn)行DNA 條形碼序列擴(kuò)增分析， 以TS和TV為縱坐標(biāo)，以遺傳距離為橫坐標(biāo)，建立二維坐標(biāo)圖用以估計(jì)DNA序列堿基飽和度狀況。圖1顯示，TS、TV隨著P距離的增加而線性增加， 未表現(xiàn)出飽和態(tài)勢(shì)， 說明鳳凰山區(qū)茶園的蜘蛛有很強(qiáng)的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)， 堿基的位點(diǎn)及置換關(guān)系均可用于分析和解釋蜘蛛的系統(tǒng)發(fā)育， 見圖1。

2.3系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果

本試驗(yàn)中， 對(duì)74頭蜘蛛樣本采用鄰接法， 以2條盲蛛目的COⅠ序列為外群構(gòu)建鳳凰山茶區(qū)蜘蛛群落的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹， 聚類結(jié)果如圖2所示。聚類結(jié)果表明， 外群兩種盲蛛與50種蜘蛛被劃分為姐妹群，74個(gè)蜘蛛樣本聚類后沒有出現(xiàn)物種交叉的現(xiàn)象， 50種蜘蛛各自聚成一個(gè)單系群， 不同蜘蛛被明顯區(qū)分。NJ樹中顯示， 除白觸斑蛛Euophrys albopopdis外， 其余不同種蜘蛛的支持率均超過90%以上。

2.4遺傳距離與ABGD劃分結(jié)果分析

以K2P模型計(jì)算50種蜘蛛COⅠ序列的種間遺傳距離結(jié)果表明，522條序列的種間平均距離為0.02～0.229，其中，黑斑蓋蛛Neriene nigripectoris與皮氏紅螯蛛Chiracanthium pichoni之間的平均遺傳距離最大，為0.229，突尾艾蛛Cyclosa conica與濁斑艾蛛Cyclosa confusa、日本艾蛛Cyclosa japonica之間平均遺傳距離最小，為0.02。74個(gè)蜘蛛樣本序列依據(jù) 1%的序列差異被分為50組。其中，除白觸斑蛛Euophrys albopopdis兩個(gè)樣本不支持該物種外， 其余蜘蛛物種全部一一對(duì)應(yīng)，DNA條形碼分子鑒定與形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果吻合度為98%（49/50）。

本試驗(yàn)對(duì)74個(gè)蜘蛛樣本（包含外群）的ABGD劃分結(jié)果包括初始劃分（initial partition）和遞歸劃分（recursive partition）兩種情況。遞歸劃分較為穩(wěn)定， 遺傳距離在0.001～0.1之間， 包括外群在內(nèi)的74個(gè)蜘蛛樣本被分成50組， 支持50個(gè)蜘蛛物種（見圖3）。而初始化分結(jié)果在0.001～0.001 7之間， 被分成42.67組，支持42.67個(gè)蜘蛛物種; 遺傳距離在0.002 8～0.004 6之間， 被劃分為48組; 遺傳距離在0.007 7～0.100 0之間，被劃分為50組。遺傳距離在42.67～50.00之間，P值范圍浮動(dòng)較大，不夠穩(wěn)定， 而遞歸劃分較為穩(wěn)定， 包括外群在內(nèi)的74個(gè)蜘蛛樣本被分成50組， 與形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果吻合度較高（表4）。ABGD的劃分結(jié)果與NJ樹呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系， 每個(gè) ABGD的劃分結(jié)果NJ發(fā)育樹上均已標(biāo)明， 如圖2所示。

3討論

本研究以鄰接法與通用引物對(duì)鳳凰山茶園的74個(gè)不同種類的蜘蛛樣本構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹， 74個(gè)樣本1%的COⅠ序列利用ABGD分成了50組， DNA條形碼技術(shù)的分子鑒定結(jié)果中， 只有白觸斑蛛不支持形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果， 其余蜘蛛物種的分子鑒定與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果高度吻合。分子閾值分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定的誤差只有2.00%， 證明了DNA條形碼技術(shù)對(duì)物種進(jìn)行分子鑒定的有效性。除白觸斑蛛外， 每個(gè)蜘蛛物種聚類明顯， 沒有出現(xiàn)物種交叉現(xiàn)象， 并且均各自聚成一個(gè)單系群， 且各單系分支的支持率均超過90%， COⅠ序列在鳳凰山茶園蜘蛛的鑒定中準(zhǔn)確性較高， 表明本研究的DNA條形碼可以作為鳳凰山蜘蛛鑒定的重要數(shù)據(jù)。

ABGD方法是基于一定范圍的先驗(yàn)值P自動(dòng)探測(cè)給定數(shù)據(jù)集的“barcoding gap”[1920]， 在一定程度ABGD減少了閾值定義的人為因素， 降低了基于最小距離法分類法界定的主觀性， 并且具有較高的準(zhǔn)確性。本研究中運(yùn)用ABGD軟件對(duì)鳳凰山蜘蛛74個(gè)樣本進(jìn)行分組劃分， 結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類鑒定的結(jié)果完全一致， 本研究初步評(píng)估了鳳凰山茶區(qū)蜘蛛物種的多樣性[21]， DNA條形碼技術(shù)為該茶區(qū)蜘蛛分類學(xué)、生態(tài)學(xué)及相關(guān)研究開拓了物種分類新的研究領(lǐng)域和更具備前沿技術(shù)的新方法， 為保護(hù)和恢復(fù)該茶區(qū)蜘蛛種群提供了可靠依據(jù)[22]。但對(duì)一些動(dòng)物分化期較短的物種， 因其極小的種內(nèi)遺傳距離， 從而導(dǎo)致基于進(jìn)化樹和遺傳距離的條形碼技術(shù)不能準(zhǔn)確鑒定這些物種。因此， DNA條形碼技術(shù)在眾多物種鑒定中還需要大量試驗(yàn)的驗(yàn)證， 才能更好地完善其在更多生物物種分類上的應(yīng)用。自然界中生物因地理區(qū)域分布、環(huán)境及氣溫等各種因素的影響，物種分化期和進(jìn)化速率不同， 只依靠DNA 條形碼技術(shù)還不能完全區(qū)分自然界中千變?nèi)f化的生物物種。因此， 運(yùn)用DNA序列的分析對(duì)蜘蛛進(jìn)行分子鑒定必須結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)方法， 才是快捷、準(zhǔn)確鑒定蜘蛛物種的科學(xué)方法[23]， 脫離傳統(tǒng)分類學(xué)而開展DNA條形碼研究不可能取得科學(xué)準(zhǔn)確的成果[2425]。由于蜘蛛存在潛在的新種、隱存種或復(fù)合種， 因此， 對(duì)蜘蛛物種進(jìn)行單分子標(biāo)記是DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵， 對(duì)某一蜘蛛選擇特征性的基因片段與其COⅠ序列共同作為DNA條形碼的標(biāo)記基因， 對(duì)這些疑難種進(jìn)行分子鑒定才能獲取更高的正確率[26]。在本研究中， 由于受到采集時(shí)間、地理區(qū)域等因素的限制， 采集的蜘蛛樣本數(shù)量偏少， 從而凸顯所鑒定的蜘蛛物種代表性欠缺。我們?cè)谝院蟮难芯恐校?將補(bǔ)充各季節(jié)和不同海拔、不同環(huán)境茶區(qū)的蜘蛛標(biāo)本， 采集更多的茶區(qū)蜘蛛DNA條形碼序列的數(shù)據(jù)， 初步構(gòu)建一個(gè)較為完整的鳳凰山茶區(qū)蜘蛛條形碼數(shù)據(jù)庫。

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（責(zé)任編輯：田喆）