黑果枸杞離體快繁技術(shù)研究

王聰慧　王鐵軍　高芳　秦彩云　陳士剛　才巨鋒　陶晶

摘要：【目的】探討黑果枸杞的組織培養(yǎng)技術(shù)，為實現(xiàn)規(guī)模化高效離體快繁提供技術(shù)依據(jù)?！痉椒ā恳院诠坭疆?dāng)年生嫩莖為外植體，研究激素組合對黑果枸杞組培苗初代、增殖以及生根培養(yǎng)的影響?！窘Y(jié)果】適合黑果枸杞初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS + 6-BA1.0 mg/L + NAA0.2 mg/L ，腋芽生長良好，萌芽率達(dá)88.61%，且玻璃化情況較少;適合微枝增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS + 6-BA0.1mg/L + NAA0.2mg/L，微枝生長速度快，增殖倍數(shù)可達(dá)4.8倍，少見玻璃化現(xiàn)象，且苗生長健壯，葉片嫩綠;適合微枝生根的培養(yǎng)基為1/2MS + IBA0.2mg/·L，生根率達(dá)98%。適宜的移栽基質(zhì)為營養(yǎng)土∶河沙∶蛭石=3∶1∶1（體積比）?！窘Y(jié)論】黑果枸杞嫩莖離體培養(yǎng)和莖芽增殖可以獲得再生植株實現(xiàn)離體快繁，本研究結(jié)果為黑果枸杞優(yōu)良種質(zhì)規(guī)?；敝程峁┝思夹g(shù)支持。

關(guān)鍵詞：黑枸杞;組織培養(yǎng);增殖培養(yǎng);生根培養(yǎng)

中圖分類號：S567.19文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-8023（2019）02-0032-05

Micropropagation of Lycium ruthenicum Murr

WANG Conghui?1， WANG Tiejun?2， GAO Fang?1， QIN Caiyun?1， CHEN Shigang?1， CAI Jufeng?1， TAO Jing?1*

（1. Jilin Provincial Academy of Forestry Sciences， Changchun 130033; 2. Jilin Dunhua Forestry Bureau， Yanbian 133700）

Abstract：[Objective] To develop tissue culture technique for theLycium ruthenicum?， and provide technical basis for large scale and efficient in vitro rapid propagation. [Method] In this study， using tender stem ofL. ruthenicumas explant， the effects of different factors on primary culture， subculture and rooting culture were studied. [Results] The results showed that： the suitable medium for axillary bud sprouting was MS + 6-BA1.0mg·L?-1 + NAA0.2mg·L?-1， in which the axillary bud germination rate reached 88.61% and the vitrification were rarely. The suitable medium for proliferation was MS + 6-BA 0.1mg·L?-1 + NAA0.2mg·L?-1， in which the plantlets grew quickly. The proliferation rate was 4.8 times， and there was no vitrification with robust seedling. The suitable medium for plantlet rooting was MS + IBA0.2mg·L?-1， in which the rooting rate reached 98%. Suitable transplanting substrates were nutritional soil ： river sand ： vermiculite = 2：1：1. [Conclusion] The in vitro culture and stem bud subculture ofLycium ruthenicumcan be used to obtain the in vitro rapid propagation of the regenerated plants. The results provide technical support for the large-scale propagation of the fine germplasm ofLycium ruthenicum.

Keywords：?Lycium ruthenicum?; tissue culture; multiplication culture; rooting culture

0引言

黑果枸杞（?Lycium ruthenicumMurr.）為茄科（Solanceae）枸杞屬（?LyciumL.）灌木?[1]。可適應(yīng)鹽堿荒地和鹽化沙地生存，是我國荒漠區(qū)特有的抗鹽抗旱野生植物，同時具有很高的經(jīng)濟(jì)價值及營養(yǎng)價值?[2-3]。其果實含有17種氨基酸?[4]，13種微量元素，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值?[5-8]，被譽(yù)為“軟黃金”?[9-10]。

由于具有較高的價值，大量的黑果枸杞野生資源被采集，導(dǎo)致野生資源難以自我恢復(fù)，分布迅速面積減小?[11-12]。黑果枸杞的扦插技術(shù)較為成熟?[11-13]，但扦插技術(shù)繁殖周期比較長。盡管黑果枸杞離體快繁技術(shù)具有一定的進(jìn)展?[14-15]，但距離規(guī)?；焖俜敝尺€有一定距離。本研究旨在研究黑果枸杞腋芽增生途徑的離體快繁技術(shù)，為規(guī)?；敝趁缒咎峁┘夹g(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗材料與方法

1.1.1外植體消毒方法

供試材料為寧夏黑果枸杞當(dāng)年生嫩枝。將當(dāng)年生嫩枝去除葉片，用洗滌劑水沖洗15 min，再用自來水沖洗1～2 h 后剪成2～3 cm 長莖段（每塊莖段帶1～2個腋芽），置于超凈工作臺中，先用75%的乙醇溶液中浸泡15～20 s后，用無菌水洗凈3～5次，再放入10%次氯酸鈣溶液中消毒15 min，用無菌水沖洗3～5次，用滅菌后的濾紙吸干莖段表面水分待用。

1.1.2初代培養(yǎng)

將消毒后的黑果枸杞嫩枝分別接種于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基內(nèi)含6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）。培養(yǎng)基內(nèi)均附加蔗糖20 g/L和瓊脂5.5 g/L，高溫高壓滅菌前將pH調(diào)節(jié)至5.75～5.80之間。每瓶接種5個外植體，每處理20個瓶，35 d后統(tǒng)計其生長情況。培養(yǎng)室溫度23 ℃，初代培養(yǎng)與增殖培養(yǎng)時光強(qiáng)度為1 000～1 600 lx，生根和移栽培養(yǎng)時光照強(qiáng)度為1 600～2 000 lx，每天光照培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h。

1.1.3增殖培養(yǎng)

選取初代培養(yǎng)長勢良好的組培苗，以MS為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基內(nèi)含6-BA（0.1、0.2、0.4 mg/L）、NAA（0.1、0.2、0.4 mg/L）。其他條件同1.1.2，35 d 后統(tǒng)計試驗結(jié)果。

1.1.4試管內(nèi)生根培養(yǎng)

選取長勢良好的組培苗用于生根培養(yǎng)試驗，將增殖培養(yǎng)后的健壯小苗截成2.5 cm長莖段接種在含有IBA（0.05、0.1、0.2 mg/L）的1/2MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基內(nèi)均附加蔗糖20 g/L、NAA0.2 mg/L 和瓊脂5.5 g/L，高溫高壓滅菌前將pH調(diào)節(jié)至5.75～5.80之間。每瓶接種5個外植體，每處理20個瓶，15 d統(tǒng)計其生根率及根數(shù)。

1.1.5組培苗移栽

在培養(yǎng)室內(nèi)打開培養(yǎng)瓶瓶口煉苗2～4 d，選取生根狀況良好的植株移栽于營養(yǎng)缽內(nèi)，移栽前洗凈小苗上沾有的培養(yǎng)基，用0.1%多菌靈浸泡根系，營養(yǎng)缽內(nèi)培養(yǎng)基質(zhì)為營養(yǎng)土∶河沙∶蛭石（體積比）=3∶1∶1?；|(zhì)使用前需要121 ℃ 高溫高壓滅菌20 min，移栽前0.1%多菌靈噴灑基質(zhì)，移栽后用保鮮膜遮蓋置于23 ℃自然光培養(yǎng)7 d ，然后置于1 600～2 000 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)， 10 d后統(tǒng)計成活率。

1.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計算平均值、增殖率等;利用SPSS 19對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析等。

2結(jié)果與分析

2.1黑果枸杞嫩芽的初代培養(yǎng)

不同濃度的 6-BA 和 NAA 組合，對腋芽的萌發(fā)影響差異顯著（表1）。當(dāng)6-BA濃度較低時，整體呈現(xiàn)發(fā)育緩慢和長勢弱的現(xiàn)象，當(dāng)6-BA濃度較高時，整體呈現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。初代培養(yǎng)時，腋芽在MS + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L上第7天開始萌動，生長狀況良好，腋芽呈嫩綠色，基本無玻璃化現(xiàn)象，25 d后萌發(fā)率可達(dá)88.61%，顯著高于其他組合。

2.2黑果枸杞嫩芽的增殖培養(yǎng)

不同濃度NAA與6-BA組合對增殖倍數(shù)的影響差異顯著（表2）。當(dāng)6-BA濃度升高到0.2 mg/L時，開始出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，如圖1（a）所示。當(dāng)NAA和6-BA 濃度均較低時組培苗表現(xiàn)出長勢弱和葉片發(fā)黃的現(xiàn)象，如圖1（b）所示。在6-BA和NAA的9個組合中，較適合組培苗增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：MS + 6-BA 0.1mg/L + NAA0.2mg/L，在該培養(yǎng)條件下可使黑枸杞組培苗增殖培養(yǎng)達(dá)到最佳效果，如圖1（c）所示。

2.3IBA對黑果枸組培苗生根影響

把增殖培養(yǎng)得到的微枝接種到生根培養(yǎng)基上，7 d 后，開始生根。15 d 后大量生根。不同處理的平均生根率之間差異顯著（表3）。隨著IBA濃度的增加，組培苗的生根率及生根數(shù)量呈增加趨勢，且根系的生長狀況逐漸變好。當(dāng)IBA濃度為0.05 mg/L時生根率較低，如圖2（a）所示。當(dāng)IBA濃度為0.2 mg/L時，黑枸杞組培苗的生根培養(yǎng)效果最佳，如圖2（b）（c）所示，生根率達(dá)98%，生根數(shù)也最多。

2.4組培苗移栽

黑果枸杞組培苗在營養(yǎng)土∶河沙∶蛭石（體積比）= 2∶1∶1的基質(zhì)中成活率最高（93%左右），新生根豐富，該基質(zhì)為適宜培養(yǎng)基質(zhì)。

3討論

黑果枸杞組培苗在生長過程中易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，據(jù)文獻(xiàn)報道很多種植物的組織培養(yǎng)過程中都存在玻璃化問題?[14-17]。黑果枸杞的玻璃化問題的原因可能是前期培養(yǎng)條件不適引起的，且部分處理激素濃度不適導(dǎo)致。適合黑果枸杞初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS + 6-BA1.0 mg/L + NAA0.2 mg/L，萌芽率達(dá)88.61%，且玻璃化情況較少。

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是組織培養(yǎng)中重要的組成部分，其濃度和比例是組織培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵因素之一。在本研究中適合組培苗增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS + 6-BA0.1mg/L + NAA0.2mg/L，組培苗生長速度快，增殖倍數(shù)可達(dá)4.8倍，基本無玻璃化現(xiàn)象，且苗生長健壯，葉片嫩綠。

IBA廣泛應(yīng)用于生根培養(yǎng)過程中，本研究中，進(jìn)行黑果枸杞生根試驗時，在1/2MS 培養(yǎng)基中， IBA濃度為0.2mg/L時，黑枸杞組培苗達(dá)到適宜的生長狀態(tài)，即培養(yǎng)基配為1/2MS + IBA 0.2mg/L，在該培養(yǎng)條件下，組培苗生根率高達(dá)98%，根數(shù)為8.1，且根系粗壯，基本無愈傷組織。這與生長素的機(jī)理有關(guān)系，適宜濃度的IBA能夠促進(jìn)根的分化。

4結(jié)論

適合黑果枸杞初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS + 6-BA1.0 mg/L + NAA0.2 mg/L，腋芽生長良好，萌芽率達(dá)88.61 %，且玻璃化情況較少;適合組培苗增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS + 6-BA 0.1mg/L + NAA0.2mg/L，組培苗生長速度快，增殖倍數(shù)可達(dá)4.8倍，基本無玻璃化現(xiàn)象，且苗生長健壯，葉片嫩綠;適合組培苗生根的培養(yǎng)基為1/2MS + IBA0.2mg/L，生根率達(dá)98%。適宜黑果枸杞的移栽基質(zhì)為營養(yǎng)土∶河沙∶蛭石（體積比）=3∶1∶1。本研究建立了黑果枸杞高效的離體快繁技術(shù)，為規(guī)?；敝程峁┘夹g(shù)支持。

【參考文獻(xiàn)】

[1]劉尚武.青海植物志：2卷[M].西寧：青海人民出版社，1999.

LIU S W. Qinghai flora： edition 2[M]. Xining： Qinghai Peoples Publishing House， 1999.

[2]矯曉麗，遲曉峰，董琦，等.柴達(dá)木野生黑果枸杞營養(yǎng)成分分析[J].氨基酸和生物源，2011，33（3）：60-62.

JIAO X L， CHI X F， DONG Q， et al. Analysis of nutrient composition ofLycium ruthenicumof qaidam[J]. Amin Acids & Biotic Resources， 2011， 33（3）：60-62.

[3]馬繼雄.道地藥材黑果枸杞的應(yīng)用研究進(jìn)展及青海的發(fā)展前景[J].青海師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，28（3）：53-56.

MA J X. The fruit ofLycium ruthenicumthe application of the research development and prospect of the development of Qinghai Province[J]. Journal of Qinghai Normal University （Natural Science）， 2012，28（3）：53-56.

[4]陳紅軍，侯旭杰，白紅進(jìn)，等.黑果枸杞中的幾種營養(yǎng)成分的分析[J].中國野生植物資源，2002（2）：55.

CHEN H J， HOU X J， BAI H J， et al. Analysis of several nutrients inLycium ruthenicum?[J]. Chinas Wild Plant Resources， 2002（2）：55.

[5]章英才，張晉寧.兩種鹽濃度環(huán)境中的黑果枸杞葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征研究[J].寧夏大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004（4）：365-367.

ZHANG Y C， ZHANG J N. Study on the morphological structure of leaves ofLycium ruthenicum?[J]. Journal of Ningxia University （Natural Science）， 2004（4）：365-367.

[6]魯海，薛紅霞，安君.枸杞組織培養(yǎng)及試管快繁試驗初報[J].內(nèi)蒙古林業(yè)，2002（7）：32.

LU H， XUE H X， AN J. Tissue culture and rapid growth test ofLycium barbarum?[J]. Inner Mongolia Forestry， 2002（7）：32.

[7]李琳，杜倩，梁素鈺.黑果枸杞無菌苗愈傷組織誘導(dǎo)體系的建立[J].林業(yè)科技，2018，43（6）：1-3.

LI L，DU Q，LIANG S Y. Establishment of Callus Induction of Non-bacterial Seedling of Lycium ruthenicum[J].Forestry Science & Technology，2018，43（6）：1-3.

[8]田惠橋.枸杞莖尖培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊，1983（6）：39.

TIAN H Q. Culture of stem tip ofLycium barbarum?[J]. Plant Physiology Communications， 1983（6）：39.

[9]沈慧，米永偉，王龍強(qiáng).外源硅對鹽脅迫下黑果枸杞幼苗生理特性的影響[J].草地學(xué)報，2012，20（3）：553-558.

SHEN H， MI Y W， WANG L Q. Effects of exogenous silicon on physiological characteristics ofLycium barbarumseedling under salt stress[J]. Acta Agrestia Sinica， 2012， 20（3）：553-558.

[10]LV X P， WANG C J， CHENG Y， et al. Isolation and structural characterization of a polysaccharide LRP4-A fromLycium ruthenicumMurr[J]. Carbohydrate Research， 2012， 365（2）：20-25.

[11]阿力同·其米克，王青鋒，等.新疆產(chǎn)藥用植物黑果枸杞遺傳多樣性的ISSR分析[J].植物科學(xué)學(xué)報，2013，31（5）：517-524.

A L T， WANG Q F， et al. ISSA Analysis on genetic diversity of medically importantLycium ruthenicumMurr. in Xinjiang[J]. Plant Science Journal， 2013， 31（5）：517-524.

[12]劉克彪，李愛德，李發(fā)明.四種生長調(diào)節(jié)劑對黑果枸杞嫩枝扦插成苗的影響[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2014，32（3）：99-103.

LIU K B， LI A D， LI F M. Effects of four kinds of growth regulators softwood on cuttings seedling inLycium ruthenicium?[J]. Nonwood Forest Research， 2014， 32（3）：99-103.

[13]馬金平，李建國，王孝，等.黑果枸杞苗木快速繁育及建園技術(shù)[J].北方園藝，2013（9）：185-187.

MA J P， LI J G， WANG X， et al. Rapid breeding ofLycium rutheniciumseedling and its gardening technology[J]. The North Garden， 2013（9）：185-187.

[14] 葛紅娟，梁美霞，戴洪義.玻璃化與正常蘋果試管苗的葉片和莖的顯微結(jié)構(gòu)比較[J].植物生理學(xué)通訊，2010，46（3）：223-227.

GA H J， LIANG M X， DAI H Y. Comparison of micro-structures of leaves and stems between vitrified and normal apple （Malus pumila Mill.） plantlets in vitro[J]. Plant Physiology Communications， 2010， 46（3）： 223-227.

[15]韓晶.‘月光”等5個棗品種的花藥離體培養(yǎng)[D].石家莊：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

HAN J. In vitro anther culture of five Chinese jujube cultivars including ‘Yueguang[D]. Shijiazhuang： Agricultural University of Hebei， 2014.

[16]高弘揚(yáng)，夏秀英，張靜雪，等.石竹玻璃化苗的顯微結(jié)構(gòu)及氣孔運(yùn)動特性[J].植物生理學(xué)報，2015，51（5）：686-694.

GAO H Y， XIA X Y， ZHANG J X， et al. Microstructure and stomate movement characteristic of Hyperhydric Pink（?Dianthus chinensisL.）[J]. Plant Physiology Journal， 2015， 51（5）：686-694.

[17]張瑞熙，申敏，殷家明，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化油菜中幾種影響玻璃化頻率的因素[J].西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，34（4）：9-13.

ZHANG R X， SHEN M， YIN J M， et al. Some factors affecting vitrification in brassicanapus transformation mediated by a grobacterium tumefaciens[J]. Journal of Southwest University （Natural Science）， 2012， 34（4）：9-13.