甲苯胺藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法對一種白腐菌的抑制

于洪楓　牟洪波　戚大偉　俞瑩

摘要：木材是我國可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的重要部分，木材腐朽是破壞木材質(zhì)量的主要途徑之一，白腐菌是多種木腐菌中破壞木材細(xì)胞壁最為嚴(yán)重的。為抑制病原菌，提高木材利用率，利用低毒、低污染的甲苯胺藍(lán)（TB）介導(dǎo)的光動(dòng)力療法對白腐菌抑制作用進(jìn)行研究。通過牛津杯法測試不同濃度的TB（0.01、0.02、0.05 mg/mL）作用于白腐菌時(shí)，沒有觀察到抑菌作用。當(dāng)采用低功率的630nm激光激發(fā)TB時(shí)，發(fā)現(xiàn)三組濃度光敏劑TB對白腐菌均起到抑制作用，隨TB濃度增加抑菌率分別為69.67%、91.21%、99.44%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：甲苯胺藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法對白腐菌具有較好的抑菌效果，且光敏劑濃度與其抑菌效果呈現(xiàn)正相關(guān)性，體現(xiàn)了良好的木材防腐效果。

關(guān)鍵詞：光動(dòng)力療法;白腐菌;甲苯胺藍(lán);低功率激光光源

中圖分類號(hào)：Q6-33;S763.15文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-8023（2019）02-0050-05

Effect of Toluidine Blue-mediated Photodynamic Therapy?on White-rot Fungi

YU Hongfeng， MU Hongbo， QI Dawei， YU Ying

（College of Science， Northeast Forestry University， Harbin 150040）

Abstract：As an important part of Chinas sustainable development strategy， woods quality is mainly destroyed by wood decay. White-rot fungus is the most serious damage to wood cell wall in various wood rot fungi. In this paper， the inhibition of white-rot fungi was studied by using low toxicity and low pollution toluidine blue （TB） mediated photodynamic therapy to inhibit pathogenic bacteria， improve wood utilization. When the different concentrations （0.01， 0.02， 0.05 mg/mL） of TB were applied to white-rot fungi by the Oxford Cup method， no bacteriostatic effect was observed. However， when TB was excited by low-power 630nm laser， it was found that the three groups of photosensitizer TB inhibited white-rot fungi， and the inhibition rates with TB concentration were 69.67%， 91.21%， and 99.44%， respectively. The experimental results show that toluidine blue-mediated photodynamic therapy has a good antibacterial effect on white-rot fungi， and the concentration of photosensitizer is positively correlated with its antibacterial effect， which reflects the good anti-corrosion effect of wood.

Keywords：Photodynamic therapy; white-rot fungus; toluidine blue; low power laser light source

0引言

與世界多國相比，我國森林資源匱乏，木材防護(hù)水平相對落后，木材的用量又多，導(dǎo)致我國森林面積和質(zhì)量都呈大幅度下降趨勢，對現(xiàn)有森林資源的保護(hù)變得尤為重要?[1]。在影響木材質(zhì)量的眾多方面中，由木腐真菌引起的木材的腐朽問題最為常見。白腐菌是木腐菌中對木材腐朽比較嚴(yán)重的，它能夠分泌木質(zhì)素降解酶，具有較強(qiáng)的木質(zhì)素降解能力?[2-3]。目前木材防腐主要以化學(xué)藥劑為主，但這些包含砷、鉻或銅的水溶性防腐劑對人類和自然環(huán)境都有較大的危害?[4]。因此，研究找到對人類和環(huán)境友好的木材防腐方法和木材防腐劑是十分必要的。

光動(dòng)力療法（Photodynamic therapy簡稱PDT）是一種潛在的抑菌治療方法，它將激發(fā)光和光敏劑結(jié)合在一起，分子氧存在的情況下產(chǎn)生包括單線態(tài)氧?[5]。單線態(tài)氧可以促進(jìn)細(xì)胞中幾個(gè)重要成分的損傷，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡?[6-8]。

甲苯胺藍(lán)（Toluidine blue 簡稱TB ）是一種陽離子苯噻嗪染料。TB作為一種光敏劑具有低毒性、良好的選擇性和光化學(xué)性等性能，是一種很不錯(cuò)的抑菌治療劑?[9-10]。

近年來，國內(nèi)在木材防腐研究多集中于低毒，低污染的新型木材防腐劑的研發(fā)。2015年程康華等研究表明：己唑醇及其衍生物對木材腐朽菌有較好的抑制作用?[11]。2017年胡生輝等研究表明樟樹水提取物對木材腐朽菌、霉菌的生長有明顯的抑制作用?[4]。目前國內(nèi)在木材防腐方面已經(jīng)取得了不錯(cuò)的進(jìn)展，但仍存在防腐工藝復(fù)雜、無法做到工業(yè)量化生產(chǎn)等不確定性問題。鑒于以上木材防腐現(xiàn)狀，本文以木腐菌中的白腐菌為研究對象，將光動(dòng)力療法用于木材防腐，找到一種低污染、低毒的防腐劑甲苯胺藍(lán)，提出了一種物理與化學(xué)防腐方法相結(jié)合的新型木材防腐方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1白腐菌的采集與篩選

于2016-2017年，從大興安嶺五營保護(hù)區(qū)的紅松林，在活立木上采集具有生命活力的木材腐朽菌的子實(shí)體，經(jīng)簡單的無菌處理后裝袋備用。利用組織分離方法?[12]經(jīng)過多次的分離與純化，將分離的菌種接種在固體培養(yǎng)基上，當(dāng)平板布滿菌絲且無雜菌時(shí)，即成功完成木腐菌的分離和篩選。對平板中的菌落進(jìn)行愈創(chuàng)木酚的顯色反應(yīng)得知該菌種屬于白腐菌，通過形態(tài)學(xué)觀察法初步確定該菌種屬于白腐菌中的層孔菌屬?[13]。

1.1.2培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：馬鈴薯洗凈去皮，稱取200 g，加入蒸餾水中煮爛，無菌紗布過濾，濾液中加入蒸餾水至1000 ml，加入20 g葡萄糖，瓊脂20 g高溫高壓滅菌20 min左右后取出錐形瓶，冷卻后在4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

斜面培養(yǎng)基：取未完全冷卻的培養(yǎng)液15 ml加入到試管內(nèi)，將試管傾斜15°擺放，待培養(yǎng)基冷卻凝固，放置在4℃冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆?[14]。

1.1.3光敏劑和光源

光敏劑TB（阿拉丁，上海）分別以0.01、0.02、0.05 mg/ml的濃度對白腐菌進(jìn)行敏化。生理溶液（0.9%氯化鈉NaCl）中溶解光敏劑TB并通過0.22 μm無菌微孔膜過濾，制備出三種濃度的光敏劑溶液，光敏劑溶液貯存在黑暗條件下備用。

光源為可調(diào)紅光激光器，波長為630 nm，輸出功率為0.65 mW，輻射面積約為0.78 cm?2，能量密度為0.83 mW/cm?2。

1.2方法

1.2.1光敏劑抑菌性的測定

從培養(yǎng)箱內(nèi)取出布滿菌絲的的斜面培養(yǎng)基，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取5 ml無菌水加入到斜面培養(yǎng)基，利用滅菌的接種針將白腐菌輕輕刮下，將含有白腐菌的溶液移入到裝有玻璃珠三角瓶內(nèi)，密封后在水浴恒溫震蕩器（SHA-C，江蘇金壇億通電子）內(nèi)震蕩10 min，直至菌絲均勻的分布在溶液內(nèi)。

采用牛津杯法測定TB的抑菌性，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用移液槍吸取1 ml孢子懸菌液滴加到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，用涂布器將孢子懸菌液均勻的涂布在平板表面，取4個(gè)滅菌的牛津杯（內(nèi)徑6 mm、外徑7.8 mm、高10 mm）放置在培養(yǎng)基表面。以0.5 ml的無菌水（空白對照）和0.01、0.02、0.05 mg/ml的光敏劑滴至牛津杯內(nèi)，封口膜封口后將平板在28±2 ℃黑暗的條件下培養(yǎng)30 d后觀察抑菌效果?[15-16]。

1.2.2激發(fā)光源的測定

為了測定光敏劑激發(fā)光源的波長，利用光譜光度法搭建的光路圖，如圖1所示。

實(shí)驗(yàn)中首先測量了超純水中甲苯胺藍(lán)的吸收光譜，以超純水作為參照，分別測量了0.01、0.02、0.05 mg/ml三種濃度甲苯胺藍(lán)的吸收光譜，根據(jù)Beer-Lambert Law計(jì)算，利用originPro 9.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出不同濃度TB的吸收光譜。

A?=lg（1/?T）=Kba。?（1）

式中：?A為吸光度;T為透射比;K?為摩爾吸光系數(shù)，它與吸收物質(zhì)的性質(zhì)及入射光的波長?λ?有關(guān);?a?為吸光物質(zhì)的濃度，mol/L;?b?為吸收層厚度，cm。

1.2.3甲苯胺藍(lán)的光敏性測定

為了驗(yàn)證TB具有良好的光敏性，是一種較好的抗菌化治療抑制劑，采用光譜光度法對TB的光敏性進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)中以氘燈為光源，630 nm紅光半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光源，AMDA（9，10-蒽基-雙亞甲基二丙二酸，C22H18O8）作為單態(tài)氧指示劑?[17]。本實(shí)驗(yàn)中：樣品為AMDA飽和水溶液、0.02 mg/ml的光敏劑TB;取3 ml AMDA飽和水溶液和1 ml 0.0 2 mg/ml的TB水溶液裝在容量為 4 ml邊長為 1 cm 的石英比色皿中，并從側(cè)面用功率密度為 0.36 mW/cm?2的630 nm 激光照射。根據(jù)Beer-Lambert Law計(jì)算，每隔三分鐘記錄AMDA的吸收光譜，根據(jù)AMDA吸收光譜隨時(shí)間變化的規(guī)律，進(jìn)行線性擬合，計(jì)算出AMDA的消耗速率，AMDA消耗速率的大小反應(yīng)了TB的光敏性強(qiáng)弱。

1.2.4菌內(nèi)光敏化作用

不同濃度TB菌內(nèi)敏化實(shí)驗(yàn)分為以下四組實(shí)驗(yàn)組：L+P+有光敏劑的情況下進(jìn)行激光照射（?n?=10 min）;L+P-僅供激光照射（?n?=10 min）;L-P+僅用光敏劑處理（?n?=10 min）;L-P-無激光輻射和光敏劑（?n?=10 min）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)組的描述，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用移液槍將1 ml的白腐菌菌懸浮液滴加至含有15 ml的液體培養(yǎng)基的玻璃試管內(nèi)，在渦旋震蕩器中震動(dòng)5 min，使白腐菌均勻的分布在液體培養(yǎng)基內(nèi)。將0.01、0.02、0.05 mg/ml三種濃度的光敏劑分為三組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)內(nèi)分為四小組實(shí)驗(yàn)，其中L+P+、L-P+組分別加入1 ml光敏劑甲苯胺藍(lán)溶液，L+P-、L-P-組分別加入1 ml生理溶液作為對照組。每小組含有5個(gè)樣本液體培養(yǎng)基，每組中的樣本液體培養(yǎng)基均在渦旋震蕩器中振動(dòng)5 min直至光敏劑均勻分布在液體培養(yǎng)基內(nèi)?[9]。

分別對每組中L+P+和L+P-組按照描述的方法進(jìn)行輻照。在室溫條件下，輻照是在黑暗條件下進(jìn)行的，防止外界光線對實(shí)驗(yàn)造成干擾。輻照后，將液體培養(yǎng)基在（28±2℃，黑暗）培養(yǎng)30 d。采用菌絲體鮮重稱重法比較白腐菌在液體培養(yǎng)基內(nèi)的菌絲的生物量，通過平均值和標(biāo)準(zhǔn)差對稱量結(jié)果進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將菌樣從液體培養(yǎng)基內(nèi)取出，對每組中的菌樣稱量（精確至0.000 1 g）得出光敏劑TB對白腐菌的抑菌率?L?。

L=T1-T2T1×100%?。（2）

式中：?T?1為L-P-組菌樣的鮮重質(zhì)量平均數(shù)，g;?T?2為L+P+組菌樣的鮮重質(zhì)量平均數(shù)，g。

2結(jié)果與分析

2.1白腐菌的鑒定

用0.1 mol/L的愈創(chuàng)木酚的乙醇溶液滴定菌落邊緣，過一段時(shí)間后滴定區(qū)域變成淺粉紅色。為了從形態(tài)學(xué)方法上鑒定分離篩選出的木腐真菌，拍攝的木腐真菌菌落形態(tài)如圖2所示。菌絲體在培養(yǎng)基上向四周蔓延生長，菌落為白色，具有蘑菇氣味，形狀是疏松的，質(zhì)地為氈狀，菌落5～6周內(nèi)擴(kuò)展到整個(gè)平皿菌落生長過程中出現(xiàn)放射紋，隨著菌落的蔓延生長中心區(qū)域變黃。圖3為40倍Leica光學(xué)顯微鏡下觀察得到，菌絲由硬壁包裹的管狀結(jié)構(gòu)，菌絲頂端呈現(xiàn)圓錐狀，可延伸生長。菌絲生長方式為分支生長，形態(tài)上菌絲較粗且無色，為無隔菌絲，且無孢子產(chǎn)生?[18]。根據(jù)《中國真菌志》，從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)初步鑒定該菌屬于白腐菌中的層孔菌屬。

2.2抑菌能力測定

為了測定無光輻射條件下光敏劑TB對該白腐菌的抑菌能力，采用牛津杯法測定。在無激光輻謝下將不同濃度光敏劑TB處理的平板培養(yǎng)30d后如圖4所示，A、B、C和D分別代表對照組無菌水、0.01、0.02和0.05 mg/ml TB，四組牛津杯均未出現(xiàn)明顯的抑菌圈。結(jié)果表明，TB在無激光輻射的條件下對白腐菌未出現(xiàn)抑制作用，且改變濃度大小也無抑菌現(xiàn)象。

2.3光源的選取

為了選取TB合適的激發(fā)光源，對不同濃度的TB采用光譜光度法測得吸收光譜法測，如圖5所示，由圖5可知0.01、0.02、0.05 mg/ml三種濃度TB的最強(qiáng)吸收峰中心分別位于628、629、629 nm處。因此，激發(fā)光敏劑TB的激發(fā)光源選擇630 nm波段的紅光作為激發(fā)光源，且這一波段的激發(fā)光源價(jià)格相對比較便宜。此外，具有長波長的激發(fā)光源對組織有更強(qiáng)的組織穿透性，能更好的達(dá)到組織內(nèi)部促進(jìn)光化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。這意味著TB作為光敏劑在抗菌化治療方面有更大的發(fā)展前景。

2.4光敏性的測定

TB和 AMDA 混合液的吸收光譜每 3 min 記錄一次，由于實(shí)驗(yàn)過程中光敏劑濃度保持不變，減掉光敏劑吸收后 AMDA 吸收光譜隨時(shí)間變化，如圖6所示。對AMDA不同時(shí)間點(diǎn)的吸收光譜進(jìn)行面積積分，結(jié)果見表1，A代表每個(gè)時(shí)間點(diǎn)AMDA的吸收光譜的面積積分值，A0代表0 min時(shí)刻的面積積分值。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，得到AMDA濃度隨時(shí)間變化的吸收光譜，如圖7所示。由圖7可知，單態(tài)氧指示劑AMDA濃度的隨時(shí)間變化呈現(xiàn)e指數(shù)變化規(guī)律。線性擬合誤差是由實(shí)驗(yàn)過程中氘燈光源不穩(wěn)定、光纖和光路在實(shí)驗(yàn)過程中有微小的震動(dòng)導(dǎo)致的。

2.5TB對菌絲抑菌效果測定

不同濃度光敏劑TB分別對白腐菌進(jìn)行光敏化，光敏化作用后在人工培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 d，對各組中菌絲鮮重進(jìn)行稱量（精確至0.000 1g），每組中白腐菌菌絲的生長鮮重量結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明，光敏劑TB介導(dǎo)的PDT對白腐菌有較好的抑制作用。在三組濃度TB對白腐菌光敏化實(shí)驗(yàn)中，每組中的L+P-組的白腐菌的鮮重質(zhì)量值都低于L-P-組的值，高于L+P+組的值。結(jié)果表明，經(jīng)激光單獨(dú)照射木材腐朽菌中的白腐菌也有一定的抑菌作用，但差異不顯著。此外，每組中的L-P-的值和L-P+的值，在不同濃度的光敏劑TB作用下，得到的白腐菌鮮重的量值都相近，說明單獨(dú)使用光敏劑敏化對白腐菌沒有抑制作用，與前文TB抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符。

通過抑菌率公式計(jì)算可知，0.01、0.02、0.05 mg/ml組中的L+P+組的抑菌率分別為69.67%、91.21%、99.44%。由抑菌率可知，在低功率的激發(fā)光輻射下，隨著光敏劑的濃度增加，對該種白腐菌的抑制效果越強(qiáng)。

3結(jié)論

本文通過從木腐真菌的子實(shí)體中分離與純化得到一種真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定該菌屬于白腐菌中的層孔菌屬。選取低污染、低毒性的苯噻嗪染料甲苯胺藍(lán)（TB）作為抑菌劑，通過牛津杯法驗(yàn)證TB自身對該種白腐菌沒有明顯的抑菌效果。但通過對菌絲敏化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在低功率的630 nm激光器的輻射條件下，光敏劑TB介導(dǎo)的PDT對木材腐朽菌中的該種白腐菌有良好的抑菌效果，且隨著光敏劑濃度的增大抑菌效果增加。通過體外對TB光敏性測試，TB具有良好的光化學(xué)性能，是一種具有很大發(fā)展前景的光敏劑。

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