小麥-長(zhǎng)穗偃麥草異染色體系篩選與鑒定

殷月輝 徐勤省 亓斐 鮑印廣 王洪剛 李興鋒

摘要：二倍體長(zhǎng)穗偃麥草（Thinopyrum elongatum （Host） A. Lve，2n=2x=14，EE）具有抗病性強(qiáng)、耐鹽堿、抗旱、多花多實(shí)等優(yōu)異性狀。為明確引進(jìn)的小麥-長(zhǎng)穗偃麥草后代種質(zhì)系的染色體遺傳組成，本研究綜合利用原位雜交與分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合田間農(nóng)藝性狀對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，16份小麥-長(zhǎng)穗偃麥草種質(zhì)系中，L20161461、L20161462兩份材料是二體異附加系，分別附加6E和7E染色體;L20160940、L20160942、L20161457、L20161459四份材料是二體異代換系，分別是4E/4D、4E/4D、1E/1D、3E/3B;與中國(guó)春相比，L20160947的千粒重增幅57.02%，達(dá)到極顯著水平;在2.2%NaCl溶液處理下，L20160940的耐鹽性高于中國(guó)春。本研究為這些材料在小麥遺傳改良中的進(jìn)一步利用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)穗偃麥草;小麥;異附加系;異代換系;原位雜交;分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S512.103.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）04-0001-06

Abstract Diploid Thinopyrum elongatum （Host A. Lve， 2n=2x=14， EE） has excellent traits such as strong disease resistance， salt and alkali resistance， drought resistance and more flowers and seeds. In order to clarify the chromosome genetic composition of the introduced wheat-Th.elongatum progeny， in situ hybridization and molecular marker techniques combined with field agronomic traits were used in the study. The results showed that among the 16 wheat-Th.elongatum lines， L20161461 and L20161462 were disomic addition lines， added with 6E and 7E chromosomes respectively. L20160940， L20160942， L20161457 and L20161459 were the disomic substitution lines of 4E/4D， 4E/4D， 1E/1D and 3E/3B， respectively. The 1 000-grain weight of L20160947 increased by 57.02% compared with that of Chinese spring， which reached a very significant level. The salt tolerance of L20160940 was higher than that of Chinese spring under the treatment of 2.2% NaCl solution. This study laid the foundation for the further utilization of these materials in the genetic improvement of wheat.

Keywords Thinopyrum elongatum;Wheat; Alien addition lines; Alien substitution lines; In situ hybridization; Molecular markers

小麥?zhǔn)鞘澜绺鞯貜V泛種植的禾本科植物，也是世界上重要的糧食作物之一。在我國(guó)，小麥作為第三大糧食作物，2016年播種面積達(dá)到2 419萬(wàn)公頃[1]。小麥的近緣物種繁多，變異多樣，具有豐富的遺傳多樣性，并且含有在小麥育種中具有重要利用價(jià)值的優(yōu)良基因[2，3]。

長(zhǎng)穗偃麥草（Thinopyrum elongatum （Host） A. Lve，2n=2x=14，EE）是應(yīng)用較廣泛的小麥野生近緣種，具有抗病性強(qiáng)、耐鹽堿、抗旱、多花多實(shí)及蛋白含量高等優(yōu)異性狀，在小麥遺傳改良中具有重要作用，是小麥寶貴的三級(jí)基因資源庫(kù)[4，5]。我國(guó)很早就將長(zhǎng)穗偃麥草應(yīng)用到普通小麥改良中。Shen等[6]對(duì)小麥-長(zhǎng)穗偃麥草二體代換系7E（7B）與小麥品系“寧7840”雜交得到的F2群體進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，將抗赤霉病基因Fhb1定位于7E的長(zhǎng)臂上。陳士強(qiáng)等[7]對(duì)中國(guó)春-二倍體長(zhǎng)穗偃麥草附加系、代換系及親本進(jìn)行赤霉病菌接種，除了證實(shí)長(zhǎng)穗偃麥草的赤霉病抗性主效基因定位于1E和7E染色體，還發(fā)現(xiàn)2E和4E染色體具有微效抗性基因，而3E、5E和6E可能存在易感基因。李玉京等[8]對(duì)中國(guó)春-長(zhǎng)穗偃麥草二體異附加系和二體異代換系進(jìn)行低磷營(yíng)養(yǎng)脅迫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4E與6E染色體上存在耐低磷營(yíng)養(yǎng)脅迫基因，而5E染色體上則存在抑制低磷脅迫的基因。Forster等[9]認(rèn)為二倍體長(zhǎng)穗偃麥草的2E和5E染色體上具有耐鹽的主效基因。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交、染色體工程的方法將長(zhǎng)穗偃麥草中抗病、耐鹽堿、多花多實(shí)等優(yōu)良基因轉(zhuǎn)入小麥遺傳背景是利用外源基因進(jìn)行小麥遺傳改良的有效手段[10]。但在遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中，會(huì)人為或自發(fā)出現(xiàn)染色體變異，因此及時(shí)對(duì)外源遺傳物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，明確其染色體組成，對(duì)后續(xù)研究尤為重要。

本研究對(duì)從CIMMYT、堪薩斯州立大學(xué)小麥資源中心等處引進(jìn)的以中國(guó)春為背景的小麥-長(zhǎng)穗偃麥草后代種質(zhì)系，利用原位雜交和分子標(biāo)記方法，并結(jié)合主要農(nóng)藝性狀、芽期耐鹽性等對(duì)其遺傳組成進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試材料

普通小麥中國(guó)春、二倍體長(zhǎng)穗偃麥草（Thinopyrum elongatum，2n=2x=14，EE）、小麥-長(zhǎng)穗偃麥草雙二倍體（2n=8x=56， AABBDDEE），以上材料由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥染色體工程育種實(shí)驗(yàn)室保存。

小麥-長(zhǎng)穗偃麥草后代種質(zhì)系均從CIMMYT、堪薩斯州立大學(xué)小麥資源中心引進(jìn)，均為中國(guó)春背景。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀鑒定 參照李立會(huì)的《小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》，對(duì)抽穗期、開花期、株高、穗型、穗長(zhǎng)、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查[11]。其中，千粒重?cái)?shù)據(jù)通過(guò)使用萬(wàn)深SC-G自動(dòng)種子考種分析及千粒重儀掃描500～1 000粒的小麥籽粒獲得。

1.2.2 芽期耐鹽性鑒定 參照NY/PZT 2001—2002 《小麥耐鹽性鑒定評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》的標(biāo)準(zhǔn)方法[11，12]進(jìn)行。在培養(yǎng)期間要注意給對(duì)照組和處理組及時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)的溶液，避免干涸。及時(shí)調(diào)查、統(tǒng)計(jì)處理組和對(duì)照組的發(fā)芽情況（胚芽鞘生長(zhǎng)到種子的1/3，種子根生長(zhǎng)到種子的1/2，視為發(fā)芽）。根據(jù)下列公式計(jì)算相對(duì)鹽害率（RGER），并分級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.2.3 細(xì)胞學(xué)觀察與原位雜交 參照裴艷茹[13]的方法對(duì)根尖細(xì)胞（RTC）染色體數(shù)目及形態(tài)進(jìn)行觀察;參照Kato等[14]的方法進(jìn)行染色體制備;參照Fu等[15]的方法進(jìn)行基因組原位雜交（GISH）。用TEXAS RED-5-dCTP標(biāo)記的二倍體長(zhǎng)穗偃麥草基因組DNA為探針，中國(guó)春基因組DNA作為封阻。鏡檢使用Nikon（ECLIPSE Ni-U型）熒光顯微鏡，用DS-Ril型CCD機(jī)（Nikon）進(jìn)行圖案采集。

1.2.4 分子標(biāo)記鑒定分析 從段亞梅[16]篩選得到的長(zhǎng)穗偃麥草特異分子標(biāo)記中選擇1E-7E特異標(biāo)記各一對(duì)（見(jiàn)表2）。PCR反應(yīng)體系為10 μL，含模板DNA（50 ng/μL）1 μL，上下游引物各1 μL，2×Power Taq PCR Master Mix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）5 μL，ddH2O 2 μL。用Bio-Rad 公司T100TMThermal Cycler進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min;然后變性30 s，50～60℃退火30 s（Touchdown），72℃延伸90 s，10個(gè)循環(huán);然后變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，25個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)由8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，定壓105 V電泳3.5 h，使用0.2%的硝酸銀溶液銀染2 min，去離子水洗滌2次，用3%的NaOH溶液顯色，然后用Tanon Gis-2010型凝膠成像系統(tǒng)照相觀察記錄分析擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要農(nóng)藝性狀

對(duì)小麥-長(zhǎng)穗偃麥草種質(zhì)材料進(jìn)行基本的田間性狀調(diào)查，結(jié)果（表3）表明，在株高方面，除L20160947株高為131.68 cm，略高于中國(guó)春（127.78 cm）外，其他材料株高在105.22～127.50 cm之間，均低于中國(guó)春。在穗長(zhǎng)方面，除L20160941的6.66 cm和L20160943的6.80 cm，其余材料的穗均比中國(guó)春（6.82 cm）長(zhǎng)，長(zhǎng)度在7.38～9.92 cm之間。除L20160943、L20160947、L20161459、L20161461、L20161462的小穗數(shù)少于中國(guó)春外，其余材料小穗數(shù)分布于23.20～27.20個(gè)，均多于中國(guó)春。穗粒數(shù)高于中國(guó)春的有13份，在49.40～78.40之間;低于中國(guó)春的有3份，穗粒數(shù)分布在43.20～45.20。千粒重高于中國(guó)春（29.83 g）的有10份，在30.00～46.84 g;低于中國(guó)春的有6份，在27.47～29.56 g。但是L20160947的千粒重相對(duì)于中國(guó)春有較大的變化，增幅高達(dá)57.02%，達(dá)到極顯著水平（圖1A），而且其粒長(zhǎng)和粒寬均優(yōu)于中國(guó)春（圖1B），抽穗期和開花期均早于中國(guó)春。

2.2 芽期耐鹽性鑒定

用350 nmol/mL NaCl（2.0%）溶液對(duì)小麥-長(zhǎng)穗偃麥草種質(zhì)材料芽期耐鹽性進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果（表4）顯示，耐鹽材料7份，占供試材料的43.75%;中耐材料5份，占供試材料的31.25%;敏感材料4份，占供試材料的25.00%;無(wú)高耐和高感材料。

對(duì)7份耐鹽材料用2.2% NaCl溶液進(jìn)一步篩選，僅得到1份耐鹽性高于中國(guó)春的材料，表現(xiàn)為敏感型，占供試材料的14.29%;其余6份材料與中國(guó)春同屬于高感材料，占供試材料的85.71%（表5）。

2.3 細(xì)胞學(xué)分析與原位雜交

為明確種質(zhì)材料的遺傳組成，首先對(duì)16份小麥-長(zhǎng)穗偃麥草后代種質(zhì)材料種子根尖有絲分裂中期細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察、統(tǒng)計(jì)，然后進(jìn)行基因組原位雜交（GISH）。L20161461、L20161462的染色體條數(shù)為44條，且有2條外源染色體;L20160940、L20160942、L20161457、L20161459四份材料的染色體條數(shù)均為42條，且有2條外源染色體（圖2）。

2.4 分子標(biāo)記

經(jīng)細(xì)胞學(xué)和原位雜交分析確定小麥-長(zhǎng)穗偃麥草后代種質(zhì)系材料中有4份異代換系和2份異附加系。為進(jìn)一步確認(rèn)外源染色體所屬的同源群，用長(zhǎng)穗偃麥草特異分子標(biāo)記，對(duì)這6份材料進(jìn)行鑒定，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖3所示。CSM-1E-1標(biāo)記在L20161457中能擴(kuò)增出目的條帶，證明L20161457為1E/1D的異代換系;CSM-3E-5標(biāo)記在L20161459中能擴(kuò)增出目的條帶，證明L20161459為3E/3B的異代換系;CSM-4E-1標(biāo)記在L20160940和L20160942中能擴(kuò)增出目的條帶，證明L20160940和L20160942為4E/4D的異代換系;CSM-6E-2標(biāo)記在L20161461中能擴(kuò)增出目的條帶，證明L20161461附加一對(duì)6E染色體;CSM-7E-1標(biāo)記在L20161462中能擴(kuò)增出目的條帶，證明L20161462附加一對(duì)7E染色體。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交的方法將外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入到小麥遺傳背景后，除了從外部性狀的變化來(lái)判斷外源遺傳物質(zhì)進(jìn)入小麥外，還要及時(shí)了解外源遺傳物質(zhì)進(jìn)入的多少、有利遺傳物質(zhì)的存在情況，對(duì)外源遺傳物質(zhì)（目的基因或染色體片段）進(jìn)行跟蹤鑒定，提高育種效率。目前，檢測(cè)小麥外源遺傳物質(zhì)的方法主要有形態(tài)學(xué)、原位雜交和分子生物學(xué)方法等[17]。

本研究綜合利用原位雜交與分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)16份小麥-長(zhǎng)穗偃麥草種質(zhì)系的染色體遺傳組成進(jìn)行鑒定，準(zhǔn)確鑒定出2份異附加系和4份異代換系。其中L20161461、L20161462兩份材料是二體附加系，分別附加6E和7E染色體，與引進(jìn)時(shí)附加的外源染色體相一致;L20160940、L20160942、L20161457、L20161459為二體代換系，分別是DS4E（4D）、DS4E（4D）、DS1E（1D）、DS3E（3B）。L20160940的原引進(jìn)外源染色體是3E，而經(jīng)鑒定是4E代換系，鑒定結(jié)果與來(lái)源染色體不匹配，可能是在繁育過(guò)程中種子混收導(dǎo)致;另3份材料的外源染色體與引進(jìn)時(shí)一致，其它材料沒(méi)有檢測(cè)到外源染色體或染色體片段的存在。

在小麥近緣物種耐鹽性鑒定方面，Omielan等[18]認(rèn)為長(zhǎng)穗偃麥草3E染色體攜有耐鹽相關(guān)基因，而本研究中L20160941（來(lái)源3E）的耐鹽性高于中國(guó)春，可能攜有耐鹽相關(guān)基因，與其研究結(jié)果一致。但二體代換系L20161459（3E/3B）耐鹽性卻低于中國(guó)春，可能有兩個(gè)原因，一是3E染色體上攜帶的耐鹽基因的功能是通過(guò)降低葉片鈉離子含量增強(qiáng)小麥苗期或成株期的耐鹽性[18，19];二是L20161459是二體代換系，雖然攜有耐鹽基因，但3E染色體上攜有的其它基因影響了耐鹽基因的表達(dá)。本研究綜合利用原位雜交與分子標(biāo)記技術(shù)鑒定此套種質(zhì)材料，不僅明確了其染色體組成，也為充分利用長(zhǎng)穗偃麥草優(yōu)異基因進(jìn)一步創(chuàng)制小麥新種質(zhì)材料奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 何中虎， 莊巧生， 程順和， 等. 中國(guó)小麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展與科技進(jìn)步[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)， 2018， 8（1）： 99-106.

[2] 董玉琛， 鄭殿升. 中國(guó)小麥遺傳資源[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2000.

[3] 王林生， 陳佩度. 普通小麥外源染色體易位系的誘導(dǎo)及其在育種上的應(yīng)用[J]. 生物學(xué)通報(bào)， 2007， 42（2）： 9-11.

[4] Dvorˇák J， Edge M， Ross K. On the evolution of the adaptation of Lophopyrum elongatum to growth in saline environments [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1988， 85（11）： 3805-3809.

[5] Zhong G Y， Dvorˇák J. Chromosomal control of the tolerance of gradually and suddenly imposed salt stress in the Lophopyrum elongatum and wheat， Triticum aestivum L. genomes [J]. Theoretical and Applied Genetics， 1995， 90（2）： 229-236.

[6] Shen X R， Ohm H. Fusarium head blight resistance derived form Lophopyrum elongatum chromosome 7E and its augmentation with Fhb1 in wheat [J]. Plant Breeding， 2006， 125（5）： 424-429.

[7] 陳士強(qiáng)， 秦樹文， 黃澤峰， 等. 基于SLAF-seq技術(shù)開發(fā)長(zhǎng)穗偃麥草染色體特異分子標(biāo)記[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2013， 39（4）： 727-734.

[8] 李玉京， 劉建中， 李濱， 等. 長(zhǎng)穗偃麥草基因組中與耐低磷營(yíng)養(yǎng)脅迫有關(guān)的基因的染色體定位[J]. 遺傳學(xué)報(bào)， 1999，26（6）： 703-710.

[9] Forster B P， Miller T E， Law C N. Salt tolerance of two wheat-Agropyron junceum disomic addition lines[J]. Genome， 1988， 30（4）： 559-564.

[10]Jiang J， Friebe B， Gill B S. Recent advances in alien gene transfer in wheat[J]. Euphytica， 1994， 73： 199-212.

[11]李立會(huì)， 李秀全. 小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2005.

[12]王萌萌， 姜奇彥， 胡正， 等. 小麥品種資源耐鹽性鑒定[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2012， 13（2）： 189-194.

[13]裴艷茹. 小麥—長(zhǎng)穗偃麥草后代種質(zhì)系的鑒定及遺傳分析[D]. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2018.

[14]Kato A， Lamb J C， Birchler J A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004， 101（37）： 13554-13559.

[15]Fu S L， Lv Z L， Qi B， et al.Molecular cytogenetic characterization of wheat-Thinopyrum elongatum addition， substitution and translocation lines with a novel source of resistance to wheat fusarium head blight[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2012， 39（2）： 103-110.

[16]段亞梅. 硬粒小麥-長(zhǎng)穗偃麥草附加系、代換系和易位系的創(chuàng)建[D]. 揚(yáng)州： 揚(yáng)州大學(xué)，2018.

[17]張超. 長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體特異PCR標(biāo)記開發(fā)[D]. 揚(yáng)州： 揚(yáng)州大學(xué)， 2009.

[18]Omielan J， Epstein E， Dvorˇák J. Salt tolerance and ionic relations of wheat as affected by individual chromosomes of salt-tolerant Lophopyrum elongatum [J]. Genome， 1991， 34（6）： 961-974.

[19]韓冉， 宮文萍， 宋健民， 等. 小麥-近緣物種染色體系耐鹽性鑒定及分子標(biāo)記篩選[J]. 麥類作物學(xué)報(bào)， 2017， 37（3）： 301-306.