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    ‘泰山紅’石榴果實花色苷和類黃酮含量變化

    2019-06-03 03:28朱峰馮立娟尹燕雷
    山東農(nóng)業(yè)科學 2019年4期
    關(guān)鍵詞:類黃酮石榴

    朱峰 馮立娟 尹燕雷

    摘要:本試驗以‘泰山紅石榴為材料、利用高效液相色譜法,研究了石榴果實發(fā)育過程中果皮和果汁中類黃酮及花色苷含量的變化。結(jié)果表明:石榴果皮、果汁中類黃酮和花色苷含量有差異,果皮高于果汁,均檢測到5種類黃酮物質(zhì)和6種花色苷物質(zhì),其中楊梅酮是主要的類黃酮物質(zhì),飛燕草-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-葡萄糖苷是主要花色苷物質(zhì)。果皮中類黃酮總量變化趨勢是先下降后上升再下降,成熟期含量為21.70 mg/100g;果汁中類黃酮總量是先上升后下降,在8月29日達到最高值10.42 mg/100g,成熟期時降至2.26 mg/100g。果皮中花色苷單糖苷含量上升,雙糖苷下降,果皮中花色苷總量整體呈上升趨勢,成熟時達49.63 mg/100g;果汁中花色苷總量也是持續(xù)上升,后期增長較快,成熟期時達到最高25.06 mg/100g。石榴果實發(fā)育過程中,相同部位的類黃酮和花色苷組分含量變化不完全相同,同種類黃酮和花色苷組分在石榴果實不同部位含量變化也不完全相同,果實著色初期同時積累類黃酮和花色苷,類黃酮含量較高, 到果實成熟后期主要為花色苷的合成。果皮花色苷總量與果皮中PAL顯著正相關(guān),果皮、果汁花色苷總量與總糖含量極顯著相關(guān)。果皮、果汁中花色苷與類黃酮總量均是負相關(guān)關(guān)系。

    關(guān)鍵詞:石榴;類黃酮;花色苷;HPLC

    中圖分類號:S665.401文獻標識號:A文章編號:1001-4942(2019)04-0044-07

    Abstract ‘Taishanhong pomegranate was selected to analyze the content changes of flavonoids (FLs) and anthocyanins (ACs) in fruit peel and juice during fruit development by HPLC. The results showed that the contents of FLs and ACs in peel and juice were different, and their contents in peel were higher than those in juice. Five FLs and six ACs were detected out in peel and juice, in which,myricetin was the major FL,and delphinidin 3-glucoside and cyanidin 3-glucoside were the major ACs. In peel, the trend of total FLs content firstly decreased then increased, and then decreased. The total FLs content was 21.70 mg/100g at mature stage. In juice, the trend of total content of FLs firstly increased and then decreased. The total FLs content reached the maximum (10.42 mg/100g) on August 29, and fell down to 2.26 mg/100g at mature stage. In peel, the content of AC glucoside fell and that of AC diglucoside rose. The total ACs content had a rising trend, and it was up to 49.63 mg/100g at mature stage. In juice, the total ACs also continued to rise, and had a rapid growth in latter period. The total content reached the maximum (25.06 mg/100g) at mature stage. The content changes of FL and AC componemts in the same part were different during the fruit development, and the content change of the same kind of FL and AC components in peel and juice were also different. FLs and ACs accumulated synchronously at the early fruit coloring stage, and ACs was the main one accumulated at the fruit ripe stage. Total ACs content and PAL were significant correlated at the 0.05 level in peel. Total ACs in peel and juice had significant correlation with total sugar content at the 0.01 level.Total ACs and total FLs contents in peel and juice were negatively correlated.

    Keywords Pomegranate; Flavonoid; Anthocyanin; HPLC

    石榴(Punica granatum? L. )屬石榴科(Punicaceae)石榴屬(Punica L.)落葉灌木或喬木,具有較高的食用、藥用及觀賞價值。石榴適合種植于半干旱氣候溫和地帶和亞熱帶氣候地區(qū),阿富汗、伊朗、中國、美國等國家均有栽培。中國石榴栽培歷史悠久,據(jù)不完全統(tǒng)計,目前,栽培面積在16萬公頃左右,形成了山東棗莊、陜西臨潼、新疆葉城、云南蒙自、四川會理、河南開封、安徽懷遠等石榴適生栽培區(qū)。

    類黃酮、花色苷廣泛存在于水果和蔬菜中,是人類膳食不可缺少的組成部分,具有抗氧化、消炎、抗癌等生理功能[1,2]。類黃酮包含花色苷?;ㄉ漳軌蛭齽游镞M行受粉和種子傳播,可用于食品、化妝品和藥物糖衣的著色等方面。類黃酮、花色苷是影響石榴果實著色的主要物質(zhì),除影響果實外觀品質(zhì)外,還與果實內(nèi)在品質(zhì)、營養(yǎng)價值具有極高的相關(guān)性。前人對石榴類黃酮、花色苷的研究開展較早,但主要是對其總量的測定[3,4],對花色苷組分的研究也主要集中在果汁中[5-7],對果皮類黃酮、花色苷組分及含量的報道也有所涉及[8,9]。但同時對石榴果皮和果汁中類黃酮和花色苷物質(zhì)動態(tài)變化規(guī)律的研究鮮有報道。本研究以‘泰山紅石榴為試材,利用HPLC技術(shù),分析石榴生長發(fā)育過程中果皮、果汁中類黃酮和花色苷物質(zhì)組分及含量的動態(tài)變化及差異,旨在了解石榴果實類黃酮、花色苷物質(zhì)的變化特點,以期為石榴果實類黃酮和花色苷物質(zhì)的形成、積累和轉(zhuǎn)化研究提供一定的參考,同時提高對石榴果皮著色和果汁營養(yǎng)價值的認識。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    供試品種‘泰山紅定植于萬吉山基地石榴種質(zhì)資源圃。該資源圃立地條件、管理水平一致。選取長勢良好、樹冠大小基本一致的植株,于2017年8月8日到9月19日從樹冠不同方向采集大小基本一致的石榴果實,每隔7天采樣一次,每次采集20個果實。采后低溫條件下帶至山東省果樹研究所觀賞園藝室,將果皮和籽粒分開,籽粒手工壓榨后經(jīng)三層紗布過濾得到果汁。

    1.2 主要試劑

    類黃酮標準品楊梅酮購自Sigma公司,芹菜素購自ChromaDex公司,槲皮素、木犀草素和山奈素購自中國藥品生物制品檢定所?;ㄉ諛藴势凤w燕草-3-葡萄糖苷和飛燕草-3,5-二葡萄糖苷購自ChromaDex公司,天竺葵-3-葡萄糖苷和矢車菊-3,5-二葡萄糖苷購自Sigma公司,矢車菊-3-葡萄糖苷購于Polyphenols公司,天竺葵-3,5-二葡萄糖苷購于Fluka公司。甲醇和甲酸均為色譜級,水為Milli-Q超純水。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 類黃酮的提取 取0.5 g果皮和10 g果汁,分別放入40 mL的62.5%甲醇水溶液中,添加BHA(2 g/L),仔細加入6 mol/L HCl 10 mL,使總體積達到50 mL;置于90℃水浴中回流2 h,冷卻至室溫,超聲處理5 min。取5 mL提取液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進行HPLC測定。

    1.3.2 花色苷的提取 取1 g果皮和10 g果汁,分別加入8 mL 4℃預冷的0.1%鹽酸甲醇溶液,置于黑暗處浸提24 h,超聲提取15 min,14 000 r/min、4℃離心15 min,收集上清液,定容至10 mL。取5 mL溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進行HPLC測定。

    1.3.3 HPLC分析 采用Agilent 1260型高效液相色譜儀,配備Agilent 1260 VWD可變波長檢測器。色譜柱為ZORBAX SBC18柱 (150 mm×4.6 mm, 5 μm ),柱溫30℃。采用2%甲酸(A液)和甲醇溶液(B液)為流動相,進樣量為10 μL。其中類黃酮分析時的流速為0.8 mL/min。梯度洗脫程序:0~45 min,80%A液、20%B液;45~60 min,20%A液、80 %B液。檢測波長為355 nm?;ㄉ辗治鰰r的流速為1.0 mL/min。梯度洗脫程序:0~15 min,80%A液、20%B液;15~20 min,65% A液、35% B液;20~24 min,80% A液、20% B液。檢測波長510 nm。

    1.3.4 類黃酮和花色苷的定性及定量分析 定性分析根據(jù)標準品的保留時間確定;定量分析采用標準曲線法;類黃酮和花色苷總量為各組分含量的總和。

    1.3.5 PAL活性和總糖等測定 PAL活性測定參照王慧聰?shù)萚10]的方法;總糖采用蒽酮比色法[11];總酸采用酸堿滴定法[11];可溶性蛋白采用考馬斯亮藍法[11];采用手持式折光儀測定可溶性固形物含量(GB/T 12295-1990)。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    采用Microsoft Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理,利用DPS 7.05進行差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 石榴果實中類黃酮和花色苷的定性分析

    在建立的色譜條件下,分別取10 μL成熟期(9月19日)的果皮、果汁類黃酮和花色苷提取液進樣,得到果皮、果汁中類黃酮和花色苷的色譜圖。將樣品保留時間與標準品相對照,對樣品中類黃酮和花色苷組分進行定性分析,可得出楊梅酮、槲皮素、木犀草素、山奈素、芹菜素的保留時間分別為18.313、23.011、24.678、27.478、28.234 min;果皮、果汁中均可檢測到上述5種類黃酮物質(zhì);果汁中的類黃酮物質(zhì)未知峰明顯比果皮中的多(圖1),表明果汁中類黃酮物質(zhì)更多樣化。

    在本試驗條件下,對花色苷組分進行定性分析,結(jié)果如圖2所示,飛燕草-3-葡萄糖苷、飛燕草-3,5-二葡萄糖苷、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3,5-二葡萄糖苷、天竺葵-3-葡萄糖苷、天竺葵-3,5-二葡萄糖苷的保留時間分別為3.241、4.539、6.030、7.163、9.204、11.437 min。果汁中檢測到上述6種花色苷物質(zhì),果皮中僅檢測到其中5種,未檢測到天竺葵-3,5-二葡萄糖苷。

    2.2 石榴果實發(fā)育過程中類黃酮含量變化

    楊梅酮是其主要的類黃酮物質(zhì)。在果實整個發(fā)育期內(nèi),楊梅酮含量先下降后上升,9月5日達到23.02 mg/100g,后持續(xù)下降至8.60 mg/100g;槲皮素含量呈先上升后下降再上升的變化趨勢;山奈素含量呈先下降再上升再下降的變化趨勢;木犀草素與芹菜素變化趨勢相同,都是先升高后降低,其中木犀草素在果實發(fā)育過程中含量較低。成熟期的果皮中類黃酮組分含量依次是楊梅酮(8.60 mg/100g)>槲皮素(7.02 mg/100g)>芹菜素(3.61 mg/100g)>山奈素(2.12 mg/100g)>木犀草素(0.35 mg/100g)。9月5日后,楊梅酮、木犀草素、山奈素、芹菜素含量下降較為明顯。果皮中類黃酮總量變化趨勢為先下降后上升之后再下降,其在成熟期含量為21.70 mg/100g。

    果汁中類黃酮各組分含量明顯低于果皮。果汁中楊梅酮、槲皮素、木犀草素含量均呈先上升后下降的變化趨勢,山奈素和芹菜素含量則呈先上升后下降再上升再下降的變化趨勢。其中楊梅酮含量最高,并在8月29日達到最高值,為8.31 mg/100g,之后果汁中各組分含量均逐漸下降。成熟期各組分含量依次為楊梅酮(1.71 mg/100g)>槲皮素(0.23 mg/100g)>木犀草素(0.18 mg/100g)>芹菜素(0.11 mg/100g)>山奈素(0.03 mg/100g)。果汁中類黃酮總量的變化趨勢為先上升后下降,在8月29日達到最高值10.42 mg/100g,成熟期時降至2.26 mg/100g。

    2.3 石榴果實發(fā)育過程中花色苷含量變化

    果皮中6種花色苷組分含量變化結(jié)果如表2所示。在果實發(fā)育過程中,各組分含量變化存在一定差異。飛燕草-3,5-二葡萄糖苷小幅上升后,逐步下降;矢車菊-3,5-二葡萄糖苷先上升,8月29日達到最高值(2.32 mg/100g),之后下降;而天竺葵-3,5-二葡萄糖苷整個發(fā)育過程中含量較低,從0.98 mg/100g持續(xù)下降至檢測不到。飛燕草-3-葡萄糖苷由最初的0.88 mg/100g平穩(wěn)上升至成熟期的14.09 mg/100g;矢車菊-3-葡萄糖苷持續(xù)上升至成熟期的34.01 mg/100g,明顯高于其它組分;天竺葵-3-葡萄糖苷在整個過程中含量均較低。成熟期各組分含量依次是矢車菊-3-葡萄糖苷(34.01mg/100g)>飛燕草-3-葡萄糖苷(14.09 mg/100g)>天竺葵-3-葡萄糖苷(0.78 mg/100g)>飛燕草-3,5-二葡萄糖苷(0.45 mg/100g)>矢車菊-3,5-二葡萄糖苷(0.30 mg/100g)。隨著果實的成熟,果皮中單糖苷含量上升,雙糖苷含量下降,果皮中花色苷總量整體呈上升趨勢,8月29日時增幅較大,表明此時為花色苷的快速增長期。

    果汁中各組分含量變化與果皮有所不同(表2)。飛燕草-3,5-二葡萄糖苷含量先上升,達最高值(5.22 mg/100g)后一直下降;矢車菊-3,5-二葡萄糖苷呈先下降后上升再下降再上升的趨勢,但變化過程較平緩;天竺葵-3,5-二葡萄糖苷含量較低,且持續(xù)下降至0.01 mg/100g。矢車菊-3-葡萄糖苷和天竺葵-3-葡萄糖苷含量均是先下降后上升的變化趨勢,而飛燕草-3-葡萄糖苷含量則持續(xù)上升,且這三個組分在9月5日增幅較明顯。成熟期各組分含量依次是飛燕草-3-葡萄糖苷(12.01 mg/100g)>矢車菊-3-葡萄糖苷(9.15 mg/100g)>飛燕草-3,5-葡萄糖苷(2.62 mg/100g)>矢車菊-3,5-二葡萄糖苷(1.23 mg/100g)>天竺葵-3-葡萄糖苷(0.04 mg/100g)>天竺葵-3,5-二葡萄糖苷(0.01 mg/100g)。果汁中花色苷總量呈持續(xù)上升趨勢,且后期增長較快,成熟時達到最高(25.06 mg/100g)。

    2.4 石榴果實發(fā)育過程中其它指標變化和相關(guān)性分析

    由表3看出,果皮中PAL活性總體上呈先上升后下降再上升的變化趨勢;果汁中則是先下降后上升再下降再上升再下降,并在8月29日達到最高峰。隨著果實的成熟,果汁中總糖和可溶性蛋白含量整體是上升趨勢,總酸含量則持續(xù)下降至趨于平穩(wěn),可溶性固形物含量穩(wěn)步上升,成熟期稍有下降。

    3 討論與結(jié)論

    果實中的類黃酮一般顯黃色或無色,在紅色果實中作為輔助色素構(gòu)成果皮的顏色,成熟期含量升高會影響果實紅色的表現(xiàn)效果,成熟時幾種色素物質(zhì)同時存在,但果皮顏色主要由花色苷含量決定。隨著石榴果實的成熟, 果皮逐漸呈現(xiàn)紅色, 花色苷大量積累。本研究發(fā)現(xiàn),‘泰山紅石榴成熟時果皮中花色苷總量高于類黃酮總量,其中含6種花色苷組分。Fischer等[12]在石榴果皮中檢測到共9種花色苷物質(zhì);而Gil等[5]檢測到了矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3,5-二葡萄糖苷、天竺葵-3-葡萄糖苷、天竺葵-3,5-二葡萄糖苷4種花色苷。本研究與其不同的是在果皮中檢測到了飛燕草素。造成這種差異的原因可能與栽培品種、地理區(qū)域或者發(fā)育階段不同有關(guān)。本試驗成熟期時,‘泰山紅石榴果皮中矢車菊-3-葡萄糖苷和飛燕草-3-葡萄糖苷含量占到花色苷總量的96.92%,對果皮著色起主要作用。

    本研究在‘泰山紅石榴果汁中共檢測到5種類黃酮(楊梅酮、芹菜素、槲皮素、山奈素和木犀草素),這與郭長江等[4]的檢測結(jié)果相同;還檢測到6種花色苷物質(zhì)(天竺葵素、矢車菊素和飛燕草素的單糖苷和二糖苷),該結(jié)果與Mousavinejad等[7]的一致。石榴果汁中 6 種花色苷的含量隨果實成熟程度而增加,成熟早期3,5-二葡萄糖苷是主要的花色苷,其中飛燕草素衍生物是主要成分;成熟后期單糖苷的含量不斷增加,達到甚至超過雙糖苷,矢車菊素衍生成為其主要成分[13]。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)石榴果汁花色苷組分雙糖苷呈下降趨勢,而單糖苷呈上升趨勢,成熟期主要組分是飛燕草和矢車菊的單糖苷,占到果汁花色苷總量的84.44%,對于果汁的營養(yǎng)和著色起主要作用。

    鞠志國等[14]研究發(fā)現(xiàn),蘋果果皮花色苷的合成與類黃酮、酚類物質(zhì)的合成途徑幾乎同時存在而又相互制約。閆忠業(yè)等[15]則認為,蘋果中花色苷含量變化與類黃酮和總酚含量之間沒有顯著的相關(guān)性,隨花色苷含量積累類黃酮和總酚含量穩(wěn)定。而薛曉敏等[16]指出桃果皮花色苷含量與類黃酮呈極顯著負相關(guān)。本研究中石榴花色苷總量與類黃酮的總量是負相關(guān),但并不顯著,果實著色初期同時積累類黃酮和花色苷,此時類黃酮含量較高, 到果實成熟后期主要為花色苷。在花色苷上升幅度較大的時間段,類黃酮含量下降。由于石榴中存在著大量的酚類物質(zhì),這些酚類物質(zhì)主要通過苯丙基代謝途徑合成,其中黃烷酮在黃烷酮3-羥化酶(F3H)的催化下形成二氫黃酮醇類產(chǎn)物,這些產(chǎn)物為黃酮醇、類黃酮、花色苷等代謝支路提供前體物[17],因而,在石榴果實發(fā)育過程中,由于多個代謝支路的共存,類黃酮、花色苷之間存在著底物競爭關(guān)系,造成了類黃酮與花色苷含量之間的消長變化。

    花色苷生物合成相關(guān)酶有 11種,目前大多數(shù)集中在PAL、CHS、DFR和UFG等酶上。PAL是催化合成反應的第一個酶。本試驗中,石榴果皮中花色苷總量與果皮PAL活性顯著相關(guān),在果汁中并不顯著。PAL與花色苷積累關(guān)系存在一定的爭議性。Arakawa[18]研究表明PAL是花色苷合成的關(guān)鍵酶,花色苷的合成需要光,PAL是光誘導酶,能阻止戊糖代謝中形成的苯丙酮酸與氨結(jié)合生成苯丙氨酸,不讓其向形成蛋白質(zhì)方向發(fā)展,而是朝著合成花色苷的方向進行。也有人認為PAL不是花色苷合成的關(guān)鍵酶[14] ,他們認為PAL雖然是催化花色苷合成第一步反應的酶,但該途徑的最終產(chǎn)物包括多種成分,如類黃酮、花色苷、木質(zhì)素、單寧、角質(zhì)等,因此PAL活性與花色苷之間的關(guān)系要受到其它產(chǎn)物合成速率的影響。

    糖酸、可溶性蛋白、可溶性固形物含量是影響果實品質(zhì)的重要因素,也是育種中衡量石榴果實性狀的重要指標之一[19]。隨著果實的成熟,果汁中總糖和可溶性蛋白含量是持續(xù)上升的,而總酸含量持續(xù)下降趨于平穩(wěn)。果實成熟是糖分不斷積累、酸度逐漸下降的過程,總酸含量下降的部分原因可能是因為果實增大和水分含量增加引起的稀釋作用,更主要是與酸代謝有關(guān)?;ㄉ帐窃谔谴x的基礎(chǔ)上由苯丙酮酸和乙酸縮合而來,細胞中花色苷的合成必須以足夠含糖量為條件[20]。本研究中,果皮、果汁花色苷含量與可溶性總糖極顯著相關(guān),說明糖的積累為花色苷的形成提供了前體物質(zhì)。富士蘋果果皮的花色苷含量和著色度與果肉還原糖和可溶性糖含量顯著正相關(guān)[21]。但是,也有研究得出與上述相反的結(jié)果。套袋處理后果實的糖含量降低,卻明顯促進著色[22]。這說明糖分只在一定范圍內(nèi)限制著色??傊?,花色苷的形成必須有糖的存在,但含糖量對花色苷的影響還會受到其他因素的制約。

    綜上,本研究揭示了石榴果實發(fā)育過程中類黃酮和花色苷的一些變化規(guī)律,石榴類黃酮和花色苷具有組織差異性,該結(jié)果有利于加深人們對石榴果實各部分營養(yǎng)價值的認識,為石榴的育種工作和綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù),而石榴果實黃酮醇、花色苷、類黃酮代謝的調(diào)控途徑、機制以及類黃酮、花色苷含量變化相關(guān)酶活性方面的問題,均有待進一步研究。

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