基于表觀遺傳的攝取型藥物轉(zhuǎn)運體表達(dá)調(diào)控是腫瘤耐藥干預(yù)的新途徑

余露山，曾 蘇

0 引 言

腫瘤是最常見的惡性疾病之一，其發(fā)病率、致死率名列前茅，嚴(yán)重威脅人們的生命健康［1］。一些化學(xué)治療藥物，效率不高，重復(fù)性差，毒性較大，特別是腫瘤對于化療藥物的多藥耐藥性成為腫瘤治療的難點。腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，又稱腎腺癌（簡稱腎癌），占腎惡性腫瘤的90%，占人類惡性腫瘤的2%～3%；70%～85%腎癌為透明性腎細(xì)胞癌（clear cell RCC，ccRCC）［2］。目前，在局限于腎及其局部淋巴結(jié)的RCC患者中，腎切除術(shù)或保留腎單位的腫瘤切除術(shù)是主要的治療方式，而對于轉(zhuǎn)移性RCC，細(xì)胞毒抗癌藥物如鉑類等治療在RCC中幾乎沒無益處，即RCC具有高度耐藥性，然而其機制尚未明確［3］。因此，研究腫瘤耐藥新機制，有助于發(fā)現(xiàn)藥物作用新靶標(biāo)和新療法。

1 藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體與腫瘤耐藥

藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體參與了抗腫瘤藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄（absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME）過程，對抗腫瘤藥物療效發(fā)揮起了重要的作用。目前，對腫瘤耐藥的研究多集中在腫瘤藥物作用靶點和腫瘤微環(huán)境，對腫瘤耐藥與藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體的關(guān)系研究較少；對藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的抗腫瘤藥物ADME的過程研究較多，而對藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體與腫瘤防治的關(guān)系研究較少。藥物代謝酶可以使抗腫瘤藥物激活或失活，藥物轉(zhuǎn)運體可以將抗腫瘤藥物攝取進(jìn)入或外排出腫瘤細(xì)胞，因此，藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用［4］。其中，藥物轉(zhuǎn)運體變異使抗癌藥物攝取減少或外排增加可引起耐藥，因此，藥物轉(zhuǎn)運體是腫瘤耐藥的潛在靶點和生物標(biāo)志物［5］。表1列舉了基于藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體產(chǎn)生耐藥性的部分抗腫瘤藥物，包括靶向藥物和細(xì)胞毒藥物。

表1 基于藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體產(chǎn)生耐藥性的部分抗腫瘤藥物Table 1 Some anti-tumor drugs producing drug resistance based on drug metabolizing enzymes and transporters

SLC22A2基因編碼的有機陽離子轉(zhuǎn)運體OCT2（organic cation transporter member 2），定位于人類基因組chr 6q26上，共編碼555個氨基酸，其二級結(jié)構(gòu)具有12個跨膜區(qū)域［6］。SLC22A2基因近端啟動子區(qū)含有兩個CpG島（CpG islands，CGI），分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）上游和-320～-66bp和下游+76～+644bp。另外，遠(yuǎn)端啟動子區(qū)也含有一個CGI，位于TSS上游-1605～-1402bp。SLC22A2主要分布在腎近曲小管的基底側(cè)［7］，是腎中最主要的有機陽離子轉(zhuǎn)運體［8］，在腎小管的藥物分泌和重吸收過程中發(fā)揮重要作用，因此，其功能涉及臨床上很多內(nèi)源性物質(zhì)和常用藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程，其底物包括奧沙利鉑（oxaliplatin，Oxa）等鉑類抗腫瘤藥物［9］。

鉑類藥物主要經(jīng)OCTs攝取進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，同時也經(jīng)腎小管上皮細(xì)胞基底膜上的OCTs和頂膜上的多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運蛋白MATE-2K分泌至尿液，排出體外。Burger等［10］發(fā)現(xiàn)，OCT2對各鉑類化合物的轉(zhuǎn)運能力不同，由高到低依次為奧沙利鉑、二氯環(huán)己二氨合鉑、奧馬鉑、反鉑、順鉑，而對卡鉑則沒有轉(zhuǎn)運能力。還有研究證明OCT2能顯著增加奧沙利鉑在細(xì)胞內(nèi)的積聚，增強細(xì)胞毒性［11-12］。雖然鉑類藥物也可經(jīng)其他有機陽離子轉(zhuǎn)運體如OCT1［11］、OCT3［13］攝取進(jìn)入細(xì)胞，但這些轉(zhuǎn)運體在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)較低，親和力也較弱，因此OCT2的表達(dá)水平與活性對鉑類抗癌藥尤其是奧沙利鉑在腎癌細(xì)胞中的積聚以及細(xì)胞毒性起決定作用。

2 藥物表觀遺傳學(xué)與耐藥

藥物基因組學(xué)研究的是基因序列多態(tài)性（突變）引起的藥物療效和毒性的變化，雖然藥物基因組學(xué)是臨床個體化用藥的重要因素，然而只能解釋一部分臨床藥物治療的個體差異性［14］。藥物表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)可遺傳的變化引起藥物代謝、響應(yīng)和毒性改變的機制及其應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)也通過影響編碼藥物ADME蛋白的基因表達(dá)，在臨床個體化用藥方面發(fā)揮重要作用［14-17］。表觀遺傳學(xué)為DNA序列未改變的情況下而引起的基因表達(dá)的可遺傳性改變［18］。表觀遺傳機制包括DNA甲基化、染色質(zhì)變異：組蛋白共價和非共價修飾機制、非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）。DNA甲基化是由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMT）介導(dǎo)的化學(xué)修飾，主要發(fā)生在CGI，通常與基因的轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)，且DNA甲基化是可逆的，癌癥中DNA甲基化的異常已成為研究熱點。核小體是由DNA和組蛋白形成的染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位，包含4個亞基H1-H4，組蛋白翻譯后的修飾如組蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化等能調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)及轉(zhuǎn)錄機制，其中乙?；图谆茄芯繜狳c。組蛋白甲基化指發(fā)生在H3和H4組蛋白N端精氨酸或者賴氨酸殘基上的甲基化，并不影響組蛋白電荷，其轉(zhuǎn)錄效應(yīng)取決于受影響的殘基以及甲基化程度（單、雙、三甲基化）。組蛋白乙?；梢灾泻唾嚢彼釟埢恼姾梢詼p弱組蛋白與負(fù)電荷的DNA之間的相互作用，使得染色質(zhì)構(gòu)象更為松散，通常組蛋白高乙?；龠M(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。與DNA甲基化類似，組蛋白乙?；彩强赡娴纳踔粮踊钴S，在體內(nèi)處于高度動態(tài)的狀態(tài)，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；妇S持相對平衡。ncRNA是指不編碼蛋白質(zhì)，但具有某些功能的RNA。ncRNA包括miRNA、siRNA，及片段大于200bp的lncRNA、circRNA等，其中研究最為廣泛和成熟的是miRNA。目前，miR-122、miR-34等miRNA類藥物，已批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗［19］。可見，藥物表觀基因組的改變與傳統(tǒng)的基因突變的區(qū)別在于：表觀遺傳改變是可逆的，常發(fā)生在基因的啟動子區(qū)；而基因突變則一般是不可逆的，多發(fā)生在編碼區(qū)；表觀遺傳改變的回復(fù)頻率高于基因突變的回復(fù)頻率。進(jìn)入21世紀(jì)以來，表觀遺傳修飾異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系頗受關(guān)注，很多異常修飾出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生明顯惡化之前，可以作為潛在的癌癥早期診斷和腫瘤分型的生物標(biāo)志物以及預(yù)測治療效果和預(yù)后的標(biāo)志物［20］。特別是表觀遺傳的可逆性，還可以作為藥物靶標(biāo)，研發(fā)抗腫瘤藥物和新的聯(lián)合治療方案［21-23］，如圖1所示。

圖1 表觀遺傳學(xué)機制與藥物靶標(biāo)和個體化治療的相關(guān)性Figure 1 Correlation between epigenetic mechanisms and drug targets and individualized treatment

3 腎癌耐藥的潛在靶標(biāo)OCT2

Oncomine?數(shù)據(jù)庫中Microarray數(shù)據(jù)顯示，SLC22A2基因在腎癌腫瘤組織中的mRNA表達(dá)顯著低于癌旁組織。我們檢測了46對中國患者配對RCC組織，SLC22A2基因的mRNA和蛋白表達(dá)在腎癌患者腫瘤組織中顯著低于癌旁組織［24-25］。由于OCT2是鉑類藥物攝取進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)運體，提示OCT2低表達(dá)與RCC多藥耐藥可能有關(guān)。SLC22A2基因在腎癌組織中的表觀遺傳現(xiàn)象僅有少數(shù)報道，而機制研究更少［26-27］。我們進(jìn)一步研究顯示，DNA甲基化導(dǎo)致RCC細(xì)胞系及患者中SLC22A2基因的轉(zhuǎn)錄抑制，其機制是SLC22A2基因近端啟動子區(qū)CpG島的高甲基化水平，尤其是近端啟動子區(qū)E-box位點的高甲基化，抑制了原癌基因c-MYC與E-box位點結(jié)合，c-MYC招募能力減弱引起組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶MLL1募集降低，MLL1負(fù)責(zé)催化SLC22A2基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活信號H3K4Me3，高甲基化導(dǎo)致富集在SLC22A2基因啟動子區(qū)的組蛋白修飾H3K4Me3顯著下降，最終抑制起始轉(zhuǎn)錄，下調(diào)OCT2蛋白表達(dá)水平，見圖2。根據(jù)上述機制，我們在細(xì)胞水平和RCC細(xì)胞（786-O，Caki-1）裸鼠移植瘤模型，設(shè)計了DNMT抑制劑地西他濱（Decitabin，DAC）與OCT2底物類抗癌藥物Oxa的序貫聯(lián)合用藥方案，實驗發(fā)現(xiàn)表觀遺傳藥物DAC可以有效降低RCC細(xì)胞中SLC22A2基因的甲基化水平，增加OCT2的表達(dá)并提高Oxa在腫瘤組織及細(xì)胞的蓄積，聯(lián)合用藥策略能夠逆轉(zhuǎn)耐藥，殺死腫瘤細(xì)胞。

圖2 腎細(xì)胞癌中SLC22A2表達(dá)下降的DNA甲基化調(diào)節(jié)機制Figure 2 DNA methylation regulation mechanism of down-regulation of SLC22A2 expression in renal cell carcinoma

4 總結(jié)與展望

Winter等［28］采用MALDI-TOF MS測定ccRCC轉(zhuǎn)移（n=20）和原發(fā)瘤（n=34）患者樣本，結(jié)果顯示OCT2高表達(dá)，與腎癌細(xì)胞結(jié)果和我們的研究結(jié)果有差異；并發(fā)現(xiàn)腎其他轉(zhuǎn)運體OCT3、CTR1、SLC47A1也參與了奧沙利鉑的轉(zhuǎn)運，所以，作者認(rèn)為需進(jìn)一步研究OCT2在奧沙利鉑逆轉(zhuǎn)腎癌耐藥中作用。由于OCT2表達(dá)的個體差異，采用同一個腫瘤患者配對樣本研究才能獲得差異性表達(dá)的可比性結(jié)果，我們檢測了46對ccRCC患者腎癌及其配對癌旁組織中的OCT2，無論是mRNA和蛋白表達(dá)，腎癌組織均顯著低于其癌旁組織。OCT3和CTR1在腎組織中豐度較低且與奧沙利鉑的親和力也低［11，29］。DAC處理3株腎癌細(xì)胞后并不能增加MATE1的表達(dá)。奧沙利鉑也是MATE2K的底物，負(fù)責(zé)將藥物從腎外排至尿中；與配對的癌旁組織比較，MATE2K在腎癌組織中也是低表達(dá)，其機理涉及組蛋白修飾而與DNA甲基化無關(guān)［30］。DNA的甲基化在腎癌的診治中發(fā)揮了重要的作用［31］。DAC在打開腎癌細(xì)胞上OCT2前門的同時，保持關(guān)閉MATE2K這扇后門，使得通過前門進(jìn)入的奧沙利鉑在腎癌細(xì)胞中蓄積，從而殺死腫瘤細(xì)胞。因此，鑒于OCT2在腎小管上皮細(xì)胞對鉑類抗腫瘤藥物尤其是奧沙利鉑的攝取中發(fā)揮主導(dǎo)作用，預(yù)測OCT2的表達(dá)丟失是RCC對奧沙利鉑耐藥的機制之一，我們研究發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化對腎細(xì)胞癌中OCT2表達(dá)下降的重要作用，闡明了其調(diào)節(jié)OCT2表達(dá)的機制，回答了“藥物攝取型轉(zhuǎn)運體動態(tài)修飾是腫瘤耐藥的干預(yù)靶點”這一重要科學(xué)問題。Sci Transl Med雜志高度認(rèn)可了我們的研究成果，認(rèn)為我們的研究“打開了藥物進(jìn)入癌細(xì)胞的一扇門”［25］，Nat Rev Nephrol雜志也以“腎癌：OCT2去甲基化砸開了奧沙利鉑耐藥的門”為題高度評價了我們的研究工作［32］。然而，我們的工作僅在細(xì)胞異種移植瘤動物模型上獲得驗證，還需要開展以病人源性移植瘤模型和臨床試驗研究，以期獲得DAC和奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用給藥方案的臨床治療效果數(shù)據(jù)。