經(jīng)基因分析確診的兒童原發(fā)性紅斑肢痛癥一例報(bào)告

李妍涵，金穎，劉怡，康路路，宋金青，楊艷玲△

原發(fā)性紅斑性肢痛癥（primary erythromelalgia，PEM，OMIM# 133020）是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，以不同程度的陣發(fā)性肢端灼燒樣疼痛和對(duì)溫度敏感為主要特征，伴肢端皮膚發(fā)紅，予患肢降溫如浸冷水等可緩解癥狀［1］。紅斑性肢痛癥可分為原發(fā)性及繼發(fā)性兩種，全球發(fā)病率分別約為1.1/10 萬(wàn)和0.2/10萬(wàn)［2］，兩種類型的紅斑性肢痛癥在中國(guó)均有數(shù)例報(bào)道［3-6］，具體發(fā)病率不詳。本文就1例基因診斷明確的原發(fā)性紅斑性肢痛癥的診療經(jīng)過(guò)、SCN9A基因突變特點(diǎn)進(jìn)行研究和分析。

1 病例報(bào)告

患兒 男，11歲。主因雙下肢端疼痛3年，陣發(fā)性加劇1年，于2017年5月9日就診于北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科。患兒于入院前3年無(wú)明顯誘因出現(xiàn)雙下肢端疼痛，為灼燒痛，每天約發(fā)作十余次，每次約數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘。發(fā)作與環(huán)境溫度及活動(dòng)相關(guān)，靜息時(shí)也可發(fā)作，患處浸入冷水可略緩解?；純河谌朐呵?年疼痛陣發(fā)性加劇，癥狀持續(xù)不緩解。入院查體：患兒神志清楚，精神狀態(tài)差。身高140 cm，體質(zhì)量42 kg，體溫36.7 ℃，呼吸 21 次/min，脈搏 88 次/min，血壓101/75 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）?；純喝砥つw、黏膜未見黃染及皮疹，毛發(fā)無(wú)明顯異常。淺表淋巴結(jié)未觸及腫大，口唇無(wú)發(fā)紺，甲狀腺無(wú)腫大。雙肺未聞及干濕性啰音。心界不大，心率88 次/min，律齊，未及雜音。腹平軟，肝脾肋下未觸及，移動(dòng)性濁音（-），腸鳴音3 次/min。脊柱未見明顯異常，雙下肢無(wú)水腫。睡眠差，大小便未見明顯異常。血尿便常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)、血糖、血脂、C 反應(yīng)蛋白、降鈣素原、風(fēng)濕抗體、免疫全項(xiàng)等檢查未見明顯異常。雙膝以下皮膚呈紅色，皮溫較其他部位高，觸痛明顯（圖1），雙側(cè)乳頭內(nèi)陷（圖2）?；純杭韧巢科つw活檢示表皮輕度角化過(guò)度，萎縮變薄，基底層黑色素顆粒增多，毛囊數(shù)量減少，可見小汗腺結(jié)構(gòu)，較正常形態(tài)小，提示先天性外胚葉發(fā)育不良樣改變，患兒父母健康，無(wú)親緣關(guān)系，父母家族中未有類似家族史?；純簽榈?胎，足月順產(chǎn)，圍生期未見明顯異常。

Fig.1 The patient's both lower extremities were inflamed with rough nails圖1 患兒雙下肢形態(tài)：雙下肢紅腫，趾甲粗糙

Fig.2 The patient's chest:bilateral crater nipples were found圖2 患兒胸部形態(tài)：雙側(cè)乳頭內(nèi)陷

在知情同意的情況下，留取患兒及其父母靜脈血各2 mL，使用TIANGEN 血液基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，離心柱型）提取患兒及父母外周血白細(xì)胞DNA。予患兒全外顯子測(cè)序檢查（安捷倫V6），檢出SCN9A基因突變后，由 NCBI 網(wǎng)站下載SCN9A基因 DNA 全序列（NM_002977）。采用Primer 5軟件針對(duì)全外顯子測(cè)序檢出的突變序列設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增。膠回收以及純化后，采用雙向測(cè)序法進(jìn)行基因序列分析，然后與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析。確認(rèn)患兒存在SCN9A基因c.2566G＞C（p.G856R）雜合新發(fā)突變，家系分析示父母均為野生型（圖3），符合原發(fā)性紅斑肢痛癥診斷。該突變?cè)谡?duì)照（500人）中均未檢出。因患兒存在外胚葉發(fā)育不全表型，課題組對(duì)全外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行重分析，未檢出外胚葉發(fā)育不全相關(guān)致病突變。

Fig.3 Pedigree study:a heterozygous c.2566G＞C(p.G856R)mutation was identified in the patient's SCN9A gene,which was not detected from his parents圖3 家系桑格爾測(cè)序結(jié)果：患兒存在SCN9A基因c.2566G＞C（p.G856R）新發(fā)雜合突變，患兒父母均為野生型

利用NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)和Bioedit軟件進(jìn)行人類和不同物種的Nav 1.7 蛋白同源序列比較，并運(yùn)用Mutationtaster 軟件（http://www.mutationtaster.org）及 Polyphen-2 軟件（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2）進(jìn)行突變的致病性預(yù)測(cè)。經(jīng)SIFT 和Polyphen-2 軟件致病性預(yù)測(cè)，該位點(diǎn)可能致病，經(jīng)多物種同源性分析示p.G856在多物種間高度保守（表1），可明確診斷。

Tab.1 Amino acid alignment in Nav1.7 subunits表1 Nav1.7蛋白同源序列對(duì)比

患兒雙下肢端疼痛3年，患處皮溫增高，紅斑肢痛癥臨床癥狀典型且分子診斷明確?；純弘p側(cè)乳頭內(nèi)陷，皮膚活檢示外胚葉發(fā)育不全，但外顯子層面未檢出相關(guān)基因異常。予患兒“原發(fā)性紅斑肢痛癥、外胚葉發(fā)育不全？”診斷。確診后，建議患兒以風(fēng)扇代替冷水浸泡，予非甾體抗炎藥等藥物治療后疼痛緩解不明顯，遂于解放軍總醫(yī)院行腰交感神經(jīng)節(jié)阻滯術(shù)，術(shù)后雙下肢疼痛緩解，目前仍在隨訪中。

2 討論

2.1 疾病分型 紅斑肢痛癥可分為原發(fā)性及繼發(fā)性［7］，原發(fā)性紅斑肢痛癥多于兒童期及青春期發(fā)病，無(wú)性別受累傾向，疼痛可持續(xù)終身。繼發(fā)性紅斑肢痛癥多發(fā)于存在基礎(chǔ)病的中老年患者，如繼發(fā)于骨髓增殖性疾病、免疫性疾病、糖尿病、炎癥性腸病、病毒感染、蘑菇及汞中毒等［1］。

2.2 癥狀及體征 原發(fā)性紅斑肢痛癥主要表現(xiàn)為肢端陣發(fā)性灼燒樣疼痛，患處皮膚發(fā)紅、腫脹、溫度升高，疼痛可持續(xù)數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)，有時(shí)存在晝夜節(jié)律，于清晨疼痛可緩解，將患處浸入冷水或環(huán)境溫度降低可一定程度緩解疼痛；該病通常為雙側(cè)肢端疼痛，主要為下肢受累，但約有1/3～1/4患者存在上肢疼痛；也有機(jī)體其余部位受累的報(bào)道，如頸部、耳朵、臉頰、陰囊或外陰等［1］。偶見嗅覺(jué)敏感［8］及低體溫［9］等癥狀。部分患者在疼痛發(fā)作間期可存在雷諾現(xiàn)象［1］?；继幊Ｆ茲ⅲL(zhǎng)時(shí)間冷水浸泡可加重感染，引發(fā)潰瘍、壞疽甚至截肢。合并癥在具有SCN9A基因突變的患兒中更為常見［10］。

2.3 分子病因 原發(fā)性肢痛癥與SCN9A、SCN10A及SCN11A基因相關(guān)［1，11-12］，上述基因分別編碼NaV1.7，NaV1.8及NaV1.9蛋白，其中以SCN9A基因突變最為常見。SCN9A基因位于2q24，目前已發(fā)現(xiàn)該基因至少與3 種遺傳性疾病相關(guān)：原發(fā)性紅斑肢痛癥（primary erythermalgia，IEM）、陣發(fā)性劇痛癥（paroxysmal extreme pain disorder，PEPD）和先天性無(wú)痛覺(jué)癥（congenital indifference to pain，CIP）。Yang等［13］首次明確該基因與原發(fā)性紅斑肢痛癥的相關(guān)性。SCN9A基因編碼Nav1.7 蛋白，該蛋白是鈉離子通道的成員之一，由1 977 個(gè)氨基酸組成，多于外周神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，以背根神經(jīng)和交感神經(jīng)為主，這些神經(jīng)元多數(shù)為傷害感受器，故Nav1.7 蛋白和與痛覺(jué)感受相關(guān)。突變的SCN9A基因在活化和鈍化的轉(zhuǎn)化過(guò)程中可出現(xiàn)超極化，這導(dǎo)致對(duì)小的亞門閾值的去極化的放大，進(jìn)一步證實(shí)了SCN9A基因與遺傳性神經(jīng)性疼痛有關(guān)，提示SCN9A基因突變可導(dǎo)致外周神經(jīng)及交感神經(jīng)過(guò)度興奮，引發(fā)原發(fā)性紅斑肢痛癥發(fā)生。

遺傳學(xué)方面，目前已有128 個(gè)SCN9A基因致病突變被報(bào)道（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/）。因本例患兒父母未檢出c.2566G＞C（p.G856R）突變，故該患兒為新發(fā)突變，可解釋父母未患病的原因。也有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于非新發(fā)突變，該病的發(fā)生與SCN9A基因突變的嵌合率相關(guān)，如已知致病突變c.2573T＞A（p.L858H）同時(shí)于臨床癥狀典型的患兒及其無(wú)癥狀的母親中檢出，母親無(wú)癥狀不除外與該突變位點(diǎn)低嵌合率相關(guān)，即推測(cè)患兒母親SCN9A基因野生型單倍體劑量充足，由突變基因所表達(dá)的不正常α 亞單位量少，不足以產(chǎn)生興奮性閾值的降低，所以表型正常［14］。

2.4 診斷與鑒別診斷 原發(fā)性紅斑肢痛癥可經(jīng)典型臨床癥狀、生化及遺傳學(xué)異常診斷，本例患兒臨床癥狀典型，以雙下肢疼痛起病，且患處皮膚發(fā)紅，皮溫升高，觸痛嚴(yán)重，將患肢浸入冷水可緩解疼痛，且存在SCN9A基因致病突變，符合原發(fā)性紅斑肢痛癥診斷。另外，電壓鉗（Voltage-clamp）技術(shù)可通過(guò)分析神經(jīng)纖維動(dòng)作電位進(jìn)而輔助診斷，如Wu 等［15］通過(guò)電壓鉗明確了1例中國(guó)患者因c.2477T＞A（p.F826Y）突變影響了離子通道超極化和去極化過(guò)程，從而引發(fā)疾病發(fā)生。

本例患兒存在趾甲粗糙，乳頭內(nèi)陷，皮膚活檢示外胚葉發(fā)育不全，患兒毛發(fā)、牙齒發(fā)育、聽力及排汗等未見明顯異常，現(xiàn)考慮先天性外胚葉發(fā)育不良，為除外患兒同時(shí)存在多種罕見基因突變引發(fā)的多種疾病，筆者對(duì)本例患兒已報(bào)道的外胚葉發(fā)育不全基因再次進(jìn)行分析，包括（KDF1、EDAR、MSX1、ECTD5、KRT85、HOXC13等十余種基因），并行SNP-ARRAY檢測(cè)排除大片段缺失重復(fù)，未檢出疑似致病的突變，且CNV 未見明顯異?！，F(xiàn)不除外該患者同時(shí)存在兩種基因異常引發(fā)的罕見疾病的可能（先天性外胚葉發(fā)育不良的致病突變位點(diǎn)因檢測(cè)技術(shù)及分析手段的局限性未明確），及SCN9A基因 c.2566G＞C（p.G856R）突變可能與外胚葉發(fā)育不全相關(guān)的可能。

在既往研究中，Tanaka 等［16］報(bào)道了一對(duì)該突變受累的兄妹，有典型的紅斑性肢痛癥表現(xiàn)，且姐姐（17 歲）存在身材矮小、原發(fā)性閉經(jīng)且沒(méi)有第二性征，但性激素水平無(wú)明顯異常；行功能學(xué)檢查示：與野生型相比，突變型增強(qiáng)了離子通道超極化的激活并減緩了失活，但不會(huì)使離子通道失活。另一項(xiàng)針對(duì)同一突變位點(diǎn)但不同氨基酸改變（p.G856D）的研究示，受累患兒存在典型紅斑性肢痛癥癥狀及肢體發(fā)育不良，功能研究示離子通道超極化激活，去極化快速失活和斜坡電流增加［17］。Tanaka 等［16］考慮存在該突變相關(guān)鈉離子通道障礙可能引發(fā)人體肢體發(fā)育異常，也有可能上述患兒存在其他肢體發(fā)育相關(guān)基因的突變。目前尚鮮有SCN9A基因其他突變引發(fā)肢體發(fā)育不良的報(bào)道。本文患兒肢體長(zhǎng)度及生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯異常，但不除外該鈉離子通道缺陷與外胚葉發(fā)育有一定相關(guān)性的可能。

2.5 治療 原發(fā)性紅斑肢痛癥的治療以鎮(zhèn)痛為主，可運(yùn)用藥物鎮(zhèn)痛及手術(shù)或藥物注射阻斷治療。藥物包括非甾體抗炎藥、非選擇性單胺攝取抑制劑、血管擴(kuò)張劑、抗抑郁藥、抗驚厥藥、抗組胺藥、鈉離子通道阻滯劑以及前列腺素等［1，14］。但常存在難治性疼痛，且易反復(fù)［10］。其次，可通過(guò)手術(shù)治療緩解癥狀，包括硬膜外阻滯、交感神經(jīng)節(jié)阻滯、交感神經(jīng)切除術(shù)以及臂叢阻滯等，但仍有療效欠佳、癥狀加重及復(fù)發(fā)的報(bào)道［18］。如在國(guó)內(nèi)一項(xiàng)13例患者的研究中，69.2%患者經(jīng)化學(xué)性腰交感神經(jīng)切除術(shù)后完全緩解，但其中部分SCN9A基因突變的患者術(shù)后仍復(fù)發(fā)［19］。在日常生活中，建議盡量減少冰水及冷水浸泡時(shí)間和頻率，以吹冷風(fēng)代替，減少皮膚潰瘍、感染的可能性。在家系中有相關(guān)患者的前提下，家庭成員應(yīng)及時(shí)進(jìn)行基因檢測(cè)明確是否攜帶相關(guān)突變，對(duì)有陽(yáng)性家族史的家系可通過(guò)下一胎產(chǎn)前診斷避免再次生育原發(fā)性紅斑肢痛癥患兒。本文患兒經(jīng)腰交感神經(jīng)節(jié)阻滯術(shù)后疼痛緩解，治療有效。