Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控Sp5機制的研究進(jìn)展

劉濤，宋慶高

特異性蛋白-5（Specificity protein-5，Sp5）的C-末端為81 個氨基酸組成的3 個Cys2His2 鋅指結(jié)構(gòu)，與許多基因啟動子中富含GC/GT的區(qū)域結(jié)合以介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的發(fā)生［1］。在轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白（Specificity protein，Sp）家族中，其成員Sp1～Sp9 主要以鋅離子結(jié)合的形式發(fā)揮作用，體現(xiàn)在基因調(diào)控、細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育等方面。Sp5作為Sp家族成員之一，含有5個T 細(xì)胞因子/淋巴增強因子復(fù)合物（T cell factor/lymph enhancement factor complex，TCF/LEF）結(jié)合位點，以介導(dǎo) Wnt/β-catenin 信號通路對 Sp5 的直接調(diào)控［2］。通常，在正常成熟細(xì)胞中，Wnt 信號通路處于關(guān)閉狀態(tài)。而當(dāng)Wnt 信號通路被激活時，胞質(zhì)中的β-catenin將以核易位的形式進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF結(jié)合，結(jié)合后啟動Wnt信號途徑，進(jìn)而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。Wnt/β-catenin 信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育和干細(xì)胞自我更新等多種過程中起著至關(guān)重要的作用［3］。Sp5 作為經(jīng)典 Wnt/β-catenin 信號通路的下游位點，不僅在細(xì)胞增殖、分化等方面有著重要的調(diào)控作用，還可能成為腫瘤治療過程中潛在的生物學(xué)靶點［4］?，F(xiàn)就Wnt/β-catenin-Sp5通路在組織胚胎發(fā)育、腭裂形成、腫瘤發(fā)生和不孕癥中的調(diào)控作用進(jìn)行綜述，以期為疾病的防治及進(jìn)一步的研究提供一定的思路。

1 Wnt/β-catenin通路調(diào)控Sp5在胚胎發(fā)育中的作用

1.1 在胚胎干細(xì)胞中的作用 胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESCs）是從早期胚胎或原始性腺中分離出的細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時具有無限增殖和多向分化的特性。研究發(fā)現(xiàn)，Sp5 維持小鼠ESCs 自我更新的機制與白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）的調(diào)控有關(guān)［5］。Sp5 作為 LIF 和 STAT3 的下游靶基因，與其下游Nanog 啟動子結(jié)合，從而促進(jìn)小鼠ESCs 的自我更新。Sp5促進(jìn)ESCs自我更新的作用在很大程度上依賴于鋅指結(jié)構(gòu)域，完整的鋅指結(jié)構(gòu)域是Sp5 介導(dǎo)Nanog表達(dá)和維持小鼠胚胎干細(xì)胞多能性必不可少的結(jié)構(gòu)［6］。關(guān)于Sp5 的上游信號通路，Ye 等［7-8］發(fā)現(xiàn) LIF-STAT3 和 Wnt/β-catenin 信號通路都可以在Sp5上聚合，激活LIF-STAT3-Sp5或Wnt/β-catenin-Sp5 信號通路可促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新?？梢姡琖nt/β-catenin-Sp5-Nanog信號通路對ESCs的增殖可能有一定的促進(jìn)作用。因此，了解ESCs自我更新的機制有助于研發(fā)培養(yǎng)ESCs的新條件，從而衍生出真正的ESCs。

此外，Sp5 的表達(dá)在文昌魚胚胎發(fā)育過程中也有所體現(xiàn)，Dailey 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，Sp5 在從受精卵至神經(jīng)胚的發(fā)育過程中對Wnt/β-catenin 信號有動態(tài)反應(yīng)，胚胎早期β-catenin信號的激活可引起原腸胚后期Sp5 的普遍表達(dá)。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）作為Wnt 信號通路中的負(fù)調(diào)控因子，與腸腺瘤息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）和軸蛋白（Axin）等構(gòu)成蛋白降解復(fù)合物，促進(jìn)了β-catenin磷酸化而降解，使Wnt 信號通路處于沉默狀態(tài)。 1 -Azakenpaullone（Azk）是GSK3β 的抑制劑，當(dāng)Azk 發(fā)揮功能時，其通過影響蛋白降解復(fù)合物的形成而進(jìn)一步抑制胞質(zhì)中β-catenin 的磷酸化，使β-catenin進(jìn)入胞核內(nèi)積聚，從而激活了Wnt/β-catenin信號通路。Wnt/β-catenin 通路激活后，理論上表達(dá)量應(yīng)增加的Sp5 卻在原腸胚后期發(fā)生了下降，原因可能是Wnt/β-catenin-Sp5信號通路中存在負(fù)反饋環(huán)，也可能是胚胎發(fā)育過程中Sp5 發(fā)生了異位表達(dá)，從而使原腸胚后期Sp5表達(dá)量下降。

1.2 在多能干細(xì)胞中的作用 多能干細(xì)胞（pluripotent stem cell，PSC）具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能，在器官再生、修復(fù)和疾病治療方面極具應(yīng)用價值。研究發(fā)現(xiàn)，Sp5對人PSC的正確分化至關(guān)重要。Huggins 等［10］通過染色質(zhì)免疫沉淀和測序等方法，檢測出 Sp5 是 Wnt/β-catenin 信號通路調(diào)控人PSC發(fā)育過程中的重要靶點，而且Sp5對人PSC中的Wnt轉(zhuǎn)錄程序具有負(fù)性調(diào)控作用，原因可能是Sp5通過抑制由Wnt/β-catenin 信號通路激活的其他基因的表達(dá)而發(fā)揮作用，如Sp1。此外，Weidinger等［11］在對斑馬魚的研究中發(fā)現(xiàn)，Sp5是Wnt8/β-catenin信號通路在中胚層和神經(jīng)外胚層形成過程中的直接靶點，而且Sp5 對神經(jīng)中胚層干細(xì)胞的自我更新和分化也有著重要的調(diào)節(jié)作用［12］。因此，了解 Wnt/βcatenin-Sp5在胚胎發(fā)育過程中的調(diào)控作用有助于為細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的機制提供一定的理論依據(jù)。

2 Wnt/β-catenin通路調(diào)控Sp5在組織發(fā)育中的作用

2.2 在腦組織發(fā)育中的作用 Sp5在小鼠腦的發(fā)育中也有所表達(dá)，主要體現(xiàn)在胚胎7.25（Embryonic Day 7.25，ED7.25）至ED10.5這個時期［17］。ED8.0時，Sp5在中腦和間腦中以微弱的原位雜交信號為特點出現(xiàn)表達(dá)；ED8.5 時，Sp5 表達(dá)水平在中腦和間腦背外側(cè)區(qū)域變得非常強，在間腦中，Sp5表達(dá)同時出現(xiàn)在前頂蓋和上皮組織的區(qū)域；ED9.5時，中腦背側(cè)區(qū)仍有Sp5表達(dá)，但在ED10.0—ED10.5之間逐漸消失；ED10.0 時，Sp5 開始在中腦被蓋區(qū)表達(dá)；與中腦不同，間腦前頂蓋的外側(cè)和腹側(cè)區(qū)域也表達(dá)Sp5，至少在 ED10.5 之前表達(dá)。關(guān)于 Sp5 與 Wnt/β-catenin 信號通路，F(xiàn)ujimura等［13］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠端腦中激活經(jīng)典 Wnt/β-catenin 信號通路可促使 Sp5 表達(dá)上調(diào)，表明Wnt/β-catenin-Sp5 通路也可能在腦的發(fā)育過程中有著重要的作用，然而其具體機制尚不清楚。

3 Wnt/β-catenin通路調(diào)控Sp5在疾病發(fā)生中的作用

3.1 在腭裂形成中的作用 小鼠腭突在ED11.5 時開始發(fā)育，至ED17.0 前完成，這個階段中任何環(huán)節(jié)的錯誤均可能導(dǎo)致腭裂的發(fā)生［18］。近年來，本課題組在研究鋅與小鼠腭突發(fā)育關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，缺鋅喂養(yǎng)者子代小鼠雙側(cè)腭板垂直向生長且不能正常融合，從而導(dǎo)致腭裂發(fā)生［19］；通過差異基因的篩選發(fā)現(xiàn)，在ED14.5 時，缺鋅組中Sp5-mRNA 表達(dá)量比常鋅組（30 mg/kg）高約2.23 倍，比富鋅組（100 mg/kg）高約6.78倍（圖1），其中常鋅組和富鋅組子代小鼠雙側(cè)腭板融合較好［20］?？梢奡p5與腭發(fā)育可能存在一定的關(guān)聯(lián)，推測Sp5 在腭的發(fā)育中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用［21］。關(guān)于腭突發(fā)育的信號通路，有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/βcatenin 通路相關(guān)基因發(fā)生異?？蓪?dǎo)致腭裂的發(fā)生。為研究腭裂相關(guān) Wnt 基因，Menezes 等［22］和 Vijayan等［23］通過采集臨床病例對照（腭裂病人和正常者），對其相關(guān)的11 個Wnt 基因和33 個單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs）進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Wnt3 rs142167、GSK3B rs1331459、APC rs448475 等基因多態(tài)性與唇腭裂顯著相關(guān)，表明Wnt/β-catenin 通路可直接調(diào)控腭的發(fā)育過程。然而，母體缺鋅時是否通過Wnt/β-catenin信號通路的異常激活引起Sp5 發(fā)生高表達(dá)，從而導(dǎo)致腭裂的形成，其機制尚不清楚。

Fig.1 Comparison of Sp5-mRNA expression between zinc deficiency group,normal zinc group and zinc-rich group at ED14.5圖1 ED14.5時缺鋅組與常鋅組及富鋅組Sp5-mRNA表達(dá)對比

3.2 在腫瘤形成中的作用

3.2.1 在消化系統(tǒng)腫瘤中的作用 結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤。Takahashi 等［24］先采用半定量RT-PCR的方法對結(jié)直腸癌組織和其相應(yīng)的非癌性黏膜中的Sp5 進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6例癌組織中均檢測到Sp5高表達(dá)；隨后，通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中Sp5 的表達(dá)，結(jié)果顯示10 個結(jié)直腸癌組織中9 個癌細(xì)胞的細(xì)胞核有高水平的顯色，而在基質(zhì)細(xì)胞和非癌性上皮細(xì)胞中染色較弱。Herbst 等［25］也發(fā)現(xiàn) Sp5 在幾個結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)普遍上調(diào)。然而，Miyamoto等［26］發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116 中，Sp5 的表達(dá)未被上調(diào)，原因可能是Sp5 具有上調(diào)細(xì)胞周期抑制因子P27，從而抑制HCT116細(xì)胞增殖的潛力。盡管如此，大多數(shù)學(xué)者仍認(rèn)為在這種病理狀態(tài)（如癌癥）下，Sp5表達(dá)通常會被上調(diào)［27］。Takahashi等［24］利用cDNA 微陣列技術(shù)證實了Sp5 是與Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)的基因。為進(jìn)一步檢測β-catenin 是否在結(jié)直腸癌中積累，Mologni等［28］利用病毒shRNA介導(dǎo)沉默了β-catenin、免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄因子2（ITF2）和鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS），發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的增殖率分別減少了88%、72%和45%；聯(lián)合阻斷β-catenin 和ITF2 或 KRAS，對腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了更明顯的抑制作用，說明Wnt/β-catenin信號表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖呈正相關(guān)。 關(guān)于FLYWCH1，它是一種新型的核β-catenin 抑制劑。Muhammad等［29］發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的FLYWCH1通過結(jié)合胞核內(nèi)未被磷酸化的β-catenin，有效抑制了Wnt/βcatenin 傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，選擇性阻斷了與結(jié)直腸癌細(xì)胞形態(tài)和遷移有關(guān)的下游基因表達(dá)，增加了鈣黏素介導(dǎo)的細(xì)胞附著，抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。除結(jié)直腸癌外，Wnt信號異常激活也可能導(dǎo)致胃癌、食道癌和肝細(xì)胞癌的發(fā)生［30-32］。Evason等［33］通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和微陣列分析也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因組通過特異性激活β-catenin促進(jìn)了斑馬魚肝癌的發(fā)生。

3.2.2 在乳腺癌中的作用 為了更好地了解乳腺癌發(fā)生的機制，Chen 等［34］將 Sp5 轉(zhuǎn)入未檢測到內(nèi)源性Sp5 表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 中，結(jié)果促進(jìn)其顯著生長，表明Sp5 對乳腺癌細(xì)胞的生長具有明顯的促進(jìn)作用。Hoverter 等［35］研究發(fā)現(xiàn)，Sp5通過抑制細(xì)胞周期抑制因子p21的表達(dá)，促進(jìn)了人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的生長。關(guān)于信號通路，Khramtsov 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，Wnt 信號通路的激活是基底樣乳腺癌的主要特征之一，也是乳腺癌較低生存率的表征。Lamb等［37］也發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞相比，乳腺癌干細(xì)胞中的Wnt 信號通路被異常激活，進(jìn)一步抑制Wnt 信號通路，結(jié)果顯示乳腺癌干細(xì)胞的活性降低。因此，調(diào)控Wnt/β-catenin-Sp5 通路在乳腺癌靶向治療中有著一定的潛力。

3.3 在不孕癥中的作用 人的生殖發(fā)育主要體現(xiàn)于優(yōu)質(zhì)胚胎是否能在良好的子宮內(nèi)膜上順利著床，在這個過程中，藥物干預(yù)可以促進(jìn)胚胎細(xì)胞與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的黏附。黃芩苷是從中藥黃芩中提取的一種黃酮類單體，具有改善哺乳動物生殖的功能。張玉梅等［38］研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷通過活化 Wnt/βcatenin-Sp5信號通路，使Sp5表達(dá)水平顯著升高，高表達(dá)的Sp5 通過解除Sp1 對人子宮內(nèi)膜細(xì)胞巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ（FUT4）的抑制作用，提高了人子宮內(nèi)膜細(xì)胞FUT4的蛋白表達(dá)水平，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞與胚胎細(xì)胞的黏附。這一研究理論促進(jìn)了輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，并為不孕癥的診斷和治療提供了理論基礎(chǔ)和新的思路。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，Wnt/β-catenin-Sp5 信號通路僅是復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個分支，在干細(xì)胞的維護(hù)、細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤的形成過程中發(fā)揮了重要的作用。然而，Wnt/β-catenin-Sp5 信號通路在調(diào)節(jié)機體的發(fā)育過程中可能具有雙面性：一方面在細(xì)胞誘導(dǎo)和細(xì)胞黏附中表現(xiàn)出積極的促進(jìn)作用，另一方面卻在腭突發(fā)育及腫瘤細(xì)胞形成中發(fā)揮了負(fù)性調(diào)控作用。目前，關(guān)于Sp5的報道仍然較少，其具體分子機制仍需要大量實驗去研究?？傊琒p5 可能是多種疾病預(yù)防和診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，對Wnt/β-catenin-Sp5通路的及時調(diào)控可能為防治腫瘤的轉(zhuǎn)移、腭裂及其他先天性疾病的發(fā)生提供新的思路和治療方法。