誘導(dǎo)化療后進(jìn)展期聲門上喉癌切緣及分子標(biāo)志物研究

張文超，張強(qiáng)，岳玖玲，卓姍姍，潘毅，張侖

喉癌以鱗癌為主，5年生存率為50%～70%，聲門上癌占喉癌的45%～50%［1］，對(duì)于局部進(jìn)展期（T3～4，N0～2，M0）聲門上癌，臨床常采用誘導(dǎo)化療來控制腫瘤局部生長，達(dá)完全緩解（CR）、一些部分緩解（PR）病例可行同步放化療，化療效果不佳者行手術(shù)治療。經(jīng)過誘導(dǎo)化療會(huì)形成“腫瘤退縮區(qū)”，給術(shù)中判斷腫瘤的范圍及邊緣帶來困難。有研究認(rèn)為某些標(biāo)志物與喉癌安全邊界相關(guān)，其中真核翻譯起始因子4E（eIF4E）是翻譯啟動(dòng)因子復(fù)合體關(guān)鍵部分，在很多腫瘤組織中100%表達(dá)，而在正常喉黏膜中呈陰性表達(dá)［2］；生存素（survivin）是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，在喉癌中也呈高表達(dá)，而在息肉及正常組織中無表達(dá)［3］；細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）過表達(dá)可使細(xì)胞不停地進(jìn)入細(xì)胞周期，由高到低在喉癌、乳頭狀瘤中表達(dá)［4］；P27在細(xì)胞周期中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，在喉癌、乳頭狀瘤、正常黏膜中表達(dá)逐漸升高［5］。目前對(duì)于化療后的手術(shù)切緣界定以及通過組織芯片（TMA）技術(shù)同時(shí)檢測(cè)喉癌相關(guān)的4種標(biāo)志物與切緣的關(guān)系國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本文通過TMA 技術(shù)檢測(cè)上述標(biāo)志物在腫瘤退縮后不同距離的癌旁最短切緣組織中的表達(dá)，結(jié)合與局部復(fù)發(fā)率的相關(guān)性，確定安全切緣的生物學(xué)指標(biāo)，探尋一種更為準(zhǔn)確的喉癌化療后手術(shù)切緣判定方法。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 回顧性分析2011年5月—2014年11月天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院頭頸科收治的95例（總體組）進(jìn)展期聲門上喉癌（T3～4，N0～2，M0）患者的臨床病理資料，其均行誘導(dǎo)化療，臨床、隨訪資料完整。其中CR 12例，PR 54例，病情穩(wěn)定（SD）24例，疾病進(jìn)展（PD）5例，化療有效率（CR+PR）為69.5%（66/95）。排除12例CR病例和19例PR病例進(jìn)一步行放化療而未行手術(shù)者，以及5例PD病例理論上無“腫瘤退縮區(qū)”者。最終納入59例經(jīng)過2 個(gè)周期誘導(dǎo)化療+手術(shù)治療、標(biāo)本保存完好且標(biāo)本蠟塊有充足瘤緣的喉癌患者為研究對(duì)象，男54例，女5例；年齡43～72歲，中位年齡61歲。按國際抗癌聯(lián)盟UICC（2002）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：均為聲門上型，Ⅲ期49例（T3N0M0 11例，T3N1M0 38例），Ⅳ期10例（T4N1M0 8例，T3N2M0 2例）。術(shù)式：水平半喉切除 54例，3/4 喉切除4例，次全喉切除1例。術(shù)后病理檢查均確診為鱗狀細(xì)胞癌，切緣未見癌細(xì)胞；組織學(xué)分級(jí)高分化32例，中分化24例，低分化3例。以往的臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為未化療的喉癌外科切緣應(yīng)達(dá)到5 mm 以上相對(duì)安全［6］，因此本研究按距腫瘤最短切緣（Margin）每5 mm 分為一檔：＜5 mm（Margin 1）14例、5～10 mm（Margin 2）17例及＞10 mm（Margin 3）28例，共3組。

1.1.2 臨床治療 所有患者術(shù)前均接受誘導(dǎo)化療，未接受放療，采用TPF 方案，多西他賽+順鉑+5-氟尿嘧啶（5-FU）2周期，間隔21 d。具體方案：第1天靜脈滴注多西他賽60 mg/m2+順鉑 80 mg/m2，第 2～5 天靜脈泵注 5-FU 750 mg/m2?；熃Y(jié)束后4周，依實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（RECIST1.1）［7］評(píng)估治療效果，根據(jù)化療前后喉鏡及強(qiáng)化CT 結(jié)果統(tǒng)計(jì)CR、PR 率。并行手術(shù)治療。

1.2 組織芯片的制備組織芯片制備系統(tǒng)及空心蠟?zāi)?、石蠟塊制備及蠟芯取材與點(diǎn)樣由西安艾迪生物科技有限公司完成。每組選取2 張石蠟塊，范圍45 mm×25 mm，組織陣列儀（MTA-1，美國Beecher）打出間距合適、直徑1.5 mm，深度為3～4 mm的孔，排列成8×9陣列。先將所有病例的供體蠟塊水平切片，根據(jù)切片蘇木精-伊紅（HE）染色鏡檢結(jié)果進(jìn)行標(biāo)記，觀察記錄癌灶距切緣的最短距離，在蠟塊上沿最短切緣方向定向取材，選定有代表性的癌巢、距原發(fā)癌最短距離邊緣（最短切緣）共2個(gè)標(biāo)記，用組織陣列儀細(xì)針獲取同直徑組織塊，擠壓到已打好的石蠟塊孔里，制成排列有59例原發(fā)瘤（T）、最短切緣（Margin）組織芯片蠟塊，2 張組織芯片共容納59×2=118個(gè)陣列。術(shù)中已對(duì)切除腫瘤時(shí)保留的黏膜切緣行常規(guī)病理檢測(cè)無癌細(xì)胞殘留，取喉正常黏膜組織作對(duì)照。按同樣方法組建另一組病例和陣列相同的2張組織芯片蠟塊于4 ℃密封保存，以備重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 免疫組化染色

1.3.1 主要材料 鼠抗人p27單克隆抗體（ZM0340）、兔抗人cyclinD1單克隆抗體（ZA0101）購自北京中杉金橋公司，鼠抗人eIF4E 單克隆抗體（sc9976）及兔抗人survivin 多克隆抗體（sc10811）均購自Santa Cruz Biochemology，Inc。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法組織芯片用SP 法行eIF4E 及P27 免疫組化染色［8］，ABC 法行survivin、cyclinD1 免疫組化染色［9］，實(shí)驗(yàn)步驟：室溫脫蠟，水化組織切片，蒸餾水、PBS 各3 次，予以抗原熱修復(fù)；分別加入上述4種一抗工作液過夜孵育，PBS漂洗后加入生物素標(biāo)記的二抗工作液（ABC法PBS漂洗后加ABC試劑，孵育），PBS漂洗后DAB染色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，已知的陽性切片作為陽性對(duì)照。每個(gè)檢測(cè)指標(biāo)均在另一張組織芯片上重復(fù)1次。

1.3.3 結(jié)果評(píng)定 免疫組化染色結(jié)果由2名副主任醫(yī)師以上病理醫(yī)師采用盲法對(duì)該組病例獨(dú)立進(jìn)行評(píng)判。eIF4E蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，以腫瘤胞質(zhì)出現(xiàn)明顯深棕黃色顆粒為陽性著色；CyclinD1、P27 蛋白均定位于細(xì)胞核，無背景著色情況下以細(xì)胞核中出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒者為陽性著色；survivin 在胞質(zhì)、胞核均可有陽性著色。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：eIF4E、survivin 的表達(dá)：隨機(jī)讀取10個(gè)高倍（×400）視野，按照5%的界值確定2種標(biāo)志物在外科切緣基底細(xì)胞層細(xì)胞的表達(dá)水平，如果＞5%的上皮細(xì)胞觀察到著色即判斷為陽性［10］；cyclin D1、P27 的表達(dá)：如果＞30%的上皮細(xì)胞核著色即判斷為陽性［11］。

1.4 安全切緣的評(píng)價(jià) 光鏡下觀察每個(gè)病例腫瘤退縮區(qū)和最短切緣區(qū)的細(xì)胞形態(tài)及上述標(biāo)志物表達(dá)情況，比較不同最短切緣與喉癌術(shù)后3年局部復(fù)發(fā)率的關(guān)系，評(píng)價(jià)手術(shù)安全切緣。

1.5 隨訪 隨訪期自2011年5月—2018年5月，患者術(shù)后每半年定期復(fù)診隨訪，所有患者術(shù)后隨訪期均達(dá)到36個(gè)月以上或至患者死亡，中位隨訪期42個(gè)月，無失訪。隨訪時(shí)行纖維喉鏡及CT檢查并記錄喉內(nèi)情況及有無原位局部復(fù)發(fā)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher 精確概率法分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片陣列及染色結(jié)果 排列有59例原發(fā)瘤（T）、最短切緣（M）組織芯片蠟塊，每行陣列以T開始，每對(duì)T、M組織相鄰排列，依次類推。2張組織芯片共容納59×2=118個(gè)陣列，見圖1；每個(gè)陣列組織取材完整，免疫組化染色可靠，見圖2；高倍鏡下見免疫組化陽性染色組織定位準(zhǔn)確，見圖3。

Fig.1 Tissue microarray圖1組織芯片陣列

Fig.2 Immunohistochemical staining of margins in tissue microarray under low magnification microscopy（P27,×40）圖2 低倍鏡下單個(gè)組織芯片陣列圖（P27染色，×40）

2.2 腫瘤退縮區(qū)光鏡下表現(xiàn) 療效為PR、SD 病例均可形成鏡下腫瘤退縮區(qū)，SD病例肉眼下退縮區(qū)可能不明顯，僅鏡下可見。與術(shù)前相比，術(shù)中肉眼可見化療后腫瘤可呈同心圓似的整體向心性退縮，有3例梨狀窩內(nèi)側(cè)壁腫瘤可完全消失而呈纖維化、硬化狀態(tài)（圖4A）；腫瘤退縮區(qū)鏡下改變：組織結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞形態(tài)消失，腫瘤細(xì)胞變性、壞死，被纖維組織分隔成多個(gè)細(xì)胞島（圖4B）。有的呈大片狀壞死，僅可見殘余瘤細(xì)胞島。腫瘤退縮壞死區(qū)免疫組化染色多為陰性（圖4C）。

2.3 腫瘤退縮后不同距離最短切緣的光鏡下結(jié)果比較 原發(fā)瘤化療后可見壞死及腫瘤退縮；不同切緣組術(shù)中常規(guī)病理檢查切緣均陰性。Margin 1組切緣中10例含有腫瘤退縮區(qū)（10/14），可見壞死變性的瘤細(xì)胞；Margin 2組切緣中不含腫瘤退縮區(qū)，有2例不典型增生（2/17）；Margin 3組切緣不含腫瘤退縮區(qū)（0/28），呈增生及正常黏膜上皮，見圖5。

2.4 不同切緣組eIF4E、survivin、cyclinD1、P27 的表達(dá)差異組織芯片免疫組化染色顯示，eIF4E、survivin 在原發(fā)瘤T 高表達(dá)，3 個(gè)切緣組的陽性表達(dá)率隨切緣增大急劇下降，除T組與Margin 1組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組cyclinD1、P27的陽性表達(dá)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1 The positive expressions of eIF4E,survivin,cyclinD1 and P27 in different margin groups表1 不同切緣組eIF4E、survivin、cyclinD1、P27的陽性表達(dá)例（%）

2.5 不同切緣組局部復(fù)發(fā)率比較 59例喉癌患者中術(shù)后3年復(fù)發(fā)12例（20.3%），其中Margin 1組11例（78.6%），Margin 2組1例（5.9%），Margin 3組0例，3組3年復(fù)發(fā)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=38.643，P＜0.05），Margin 1組明顯高于 Margin 2 和 Margin 3組（P＜0.05），Margin 2 與Margin 3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

外科手術(shù)是目前局部進(jìn)展期喉鱗癌主要的治療方式，且治療重心由提高生存率轉(zhuǎn)移到兼顧喉功能的保留，國內(nèi)醫(yī)院部分喉切除率較高［12］。對(duì)于局部T3以上進(jìn)展期聲門上病變，臨床常采用TPF 方案術(shù)前誘導(dǎo)化療來控制腫瘤局部生長，降低臨床分期［13］。規(guī)范化療后療效達(dá)到CR、PR 的病例可選擇同步放化療繼續(xù)治療，療效SD的患者建議手術(shù)，部分PR患者仍有強(qiáng)烈的手術(shù)愿望［14］。本研究嚴(yán)格按照規(guī)范要求選擇經(jīng)過2 周期誘導(dǎo)化療后療效SD 的24例及療效PR中一部分不接受放化療的患者實(shí)施手術(shù)。

接受術(shù)前誘導(dǎo)化療后的病例中，術(shù)中可見呈浸潤性生長的腫瘤發(fā)生向心性消退，腫瘤體積縮小，區(qū)域中組織結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞形態(tài)消失，經(jīng)鏡下證實(shí)部分腫瘤周邊轉(zhuǎn)化為“正?！苯M織，成為“腫瘤退縮區(qū)”［15］。即使療效評(píng)價(jià)為SD的病例，光鏡下也可以出現(xiàn)腫瘤壞死之后形成的退縮區(qū)，只是退縮程度小于CR、PR［16］，這給術(shù)中判斷腫瘤的范圍及邊緣帶來困難。當(dāng)誘導(dǎo)化療后少量變性的癌細(xì)胞或微癌灶只存在于腫瘤退縮區(qū)或切緣區(qū)域時(shí)，常規(guī)病理學(xué)檢查不可能對(duì)切緣組織的全部切片逐片觀察，極易造成漏檢。在病理學(xué)診斷為切緣陰性的患者中，仍有10%～30%的病例出現(xiàn)了局部復(fù)發(fā)［17］，因此誘導(dǎo)化療后形成腫瘤退縮區(qū)，使手術(shù)切緣更加難以判斷，也會(huì)對(duì)術(shù)中冰凍判斷切緣是否無瘤造成影響，留下局部復(fù)發(fā)的隱患。

在未經(jīng)化療直接手術(shù)者，經(jīng)驗(yàn)主張切緣最少達(dá)到5 mm，而目前文獻(xiàn)中切緣的名稱也不一致，有外科切緣、陰性切緣、干凈切緣、分子切緣等［6］，具體切除范圍缺乏基本的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持，僅停留在憑術(shù)者經(jīng)驗(yàn)判斷切緣是否安全的水平，不可避免對(duì)治療效果造成影響。本研究中聲門上喉切除后最短切緣是基于對(duì)術(shù)后標(biāo)本的測(cè)量，因?yàn)榫嚯x腫瘤最短的切緣是喉內(nèi)局部復(fù)發(fā)的重要影響因素，而聲門上癌切除范圍相對(duì)較大，切緣組織豐富，研究組可以取到標(biāo)本理想的最短切緣。

腫瘤在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化之前，可出現(xiàn)癌基因表達(dá)增強(qiáng)，也可能出現(xiàn)抑癌基因的下降［18-19］，誘導(dǎo)化療后不同標(biāo)志物的表達(dá)也可能出現(xiàn)改變，但誘導(dǎo)化療后手術(shù)的喉癌切緣的標(biāo)志物研究尚少見相關(guān)報(bào)道。本研究選取的eIF4E、survivin、cyclinD1、P27是研究較多的幾種與喉癌手術(shù)切緣、侵襲性及預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物，可能在不同切緣表達(dá)梯度呈現(xiàn)遞增或遞減的趨勢(shì)，與喉癌分子邊界確定有關(guān)。與常規(guī)的免疫組化方法相比，本研究利用組織芯片技術(shù)可以多指標(biāo)、高通量地對(duì)誘導(dǎo)化療后腫瘤退縮不同距離的最短切緣基因異常表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，胞核著色為主的cyclinD1 與P27 在各切緣長度組呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)；前者表達(dá)水平隨切緣距離的增加而降低，后者表達(dá)隨切緣距離的增加而升高，但尚未形成有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的表達(dá)趨勢(shì)，不適合作為切緣標(biāo)志物；eIF4E、survivin原發(fā)灶高表達(dá)，Margin 1組表達(dá)降低，但部分切緣可見腫瘤退縮區(qū)，易引起局部復(fù)發(fā)，3年局部復(fù)發(fā)主要集中在Margin 1組，占78.6%；Margin 2組表達(dá)極低，未見明顯退縮區(qū)，3年局部復(fù)發(fā)率僅占5.9%；在Margin 3組無陽性表達(dá)，也未見腫瘤退縮區(qū)及3年局部復(fù)發(fā)，提示eIF4E、survivin 是比較敏感的分子切緣指標(biāo)；進(jìn)展期聲門上癌化療后10 mm以上的距離是相對(duì)安全的切緣，化療后腫瘤有所退縮，應(yīng)該適當(dāng)擴(kuò)大手術(shù)切緣范圍，達(dá)到基本切除腫瘤退縮區(qū)，加之標(biāo)志物表達(dá)陰性，使切緣更安全。

總之，聲門上喉癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)是治療失敗和影響患者預(yù)后的重要原因，喉功能保留手術(shù)切緣的掌握非常重要。誘導(dǎo)化療后腫瘤退縮，有利于實(shí)施部分喉切除術(shù)，通過組織芯片技術(shù)高通量地對(duì)化療后喉癌手術(shù)切緣處基因趨向表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)和分析，eIF4E、survivin 可能作為評(píng)價(jià)誘導(dǎo)化療后聲門上喉癌切緣安全性比較敏感的標(biāo)志物，其陰性表達(dá)的10 mm以上的外科切緣有利于腫瘤退縮后的切緣安全。

Fig.3 Immunohistochemical positive staining of four markers in laryngeal squamous cell carcinoma under high magnification microscopy（×400）圖3 高倍鏡下4種標(biāo)志物在喉癌原發(fā)灶（T）中的免疫組化陽性染色（×400）

Fig.4 Tumor retraction mode microscopy and IHC staining after chemotherapy（×100）圖4 化療后腫瘤退縮模式鏡下表現(xiàn)及免疫組化染色（×100）

Fig.5 The shortest margins of tumor retraction area after chemotherapy圖5 化療后腫瘤退縮區(qū)最短切緣