機(jī)械加載對(duì)大鼠薄型子宮內(nèi)膜的修復(fù)作用

田甜，劉大全，2，李心樂(lè)，邵珩，張平，2△

薄型子宮內(nèi)膜是指子宮內(nèi)膜的厚度低于能夠獲得妊娠的閾厚度［1］。過(guò)度刮宮、內(nèi)分泌失調(diào)、宮腔粘連等多種因素可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜變薄，影響子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致體外受精-胚胎種植（IVF-ET）失敗，增加流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，不能維持妊娠，是目前生殖醫(yī)學(xué)界的一大難題［2］。Miwa等［3］研究表明薄型子宮內(nèi)膜的主要特征為子宮動(dòng)脈血流高阻力、腺上皮生長(zhǎng)受限、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）低表達(dá)和血管發(fā)育不良。針對(duì)這一難題，臨床上常以大劑量雌激素治療為主，加以其他輔助性治療藥物如阿司匹林、枸櫞酸氯米芬及維生素E等，但效果并不理想，甚至有些患者對(duì)藥物治療無(wú)反應(yīng)［4］。機(jī)械加載能夠在一定程度上模擬人體主動(dòng)運(yùn)動(dòng)，以一定的加載頻率對(duì)膝關(guān)節(jié)等滑膜關(guān)節(jié)進(jìn)行機(jī)械刺激，引起機(jī)體合成代謝反應(yīng)。本課題組前期研究顯示，在股骨頭壞死的動(dòng)物模型中，機(jī)械加載可通過(guò)上調(diào)VEGF 的表達(dá)促進(jìn)血管生成，同時(shí)增加血液灌注以加強(qiáng)股骨頭血管重塑和骨傷口的愈合［5］。但有關(guān)機(jī)械加載對(duì)受損子宮內(nèi)膜的修復(fù)作用尚不清楚。本研究通過(guò)建立乙醇誘導(dǎo)的薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型，初步探討機(jī)械加載對(duì)薄型子宮內(nèi)膜的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30 只雌性 SD 大鼠，SPF 級(jí)，10～12 周齡，體質(zhì)量約220～250 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和管理遵守天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定，本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑及儀器 95%乙醇購(gòu)自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑公司。青霉素購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。蘇木素-伊紅（HE）染色液購(gòu)自北京索萊寶公司。細(xì)胞增殖核抗原（Ki-67）一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。VEGF 一抗購(gòu)自武漢Proteintech 公司。二抗（生物素標(biāo)記山羊抗兔抗體）、磷酸鹽緩沖液（PBS）及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）等其他化學(xué)品購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司產(chǎn)品。光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司。機(jī)械加載治療儀器為本課題組自主研發(fā)（中國(guó)專利號(hào)：ZL 2016 2 1010131.9）。

1.2 方法

1.2.1 陰道涂片 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每日上午8：00—9：00做大鼠陰道涂片檢查。用蘸有生理鹽水的棉拭子取出陰道分泌物涂在玻片上，自然干燥后在顯微鏡下直接觀察?；蛘卟Ｆ稍锖笥?5%乙醇固定后進(jìn)行常規(guī)HE染色。通過(guò)鏡下觀察陰道脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化確定大鼠動(dòng)情周期的各階段，并詳細(xì)記錄變化規(guī)律。

1.2.2 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只大鼠分成假手術(shù)組（Sham組），薄型子宮內(nèi)膜模型組（TE組）和機(jī)械加載治療組（TE+L組），每組10 只。Sham組宮腔注射生理鹽水，TE組宮腔注射95%乙醇建立薄型子宮內(nèi)膜模型，TE+L組造模次日接受機(jī)械加載治療，連續(xù)治療3個(gè)動(dòng)情周期即15 d。

1.2.3 模型制備 取處于動(dòng)情期的雌性SD 大鼠，2.5%異氟烷吸入麻醉，仰臥位固定，正中逐層切開(kāi)腹部，暴露一側(cè)子宮，用0號(hào)縫合絲線活結(jié)結(jié)扎子宮兩端，見(jiàn)圖1。用1 mL注射器將0.3 mL 的95%乙醇緩慢注入宮腔內(nèi)，保持宮腔充盈狀態(tài)，2 min 后再注射0.1 mL，連續(xù)2 次，另一側(cè)子宮同樣處理。反復(fù)沖洗宮腔，恢復(fù)子宮解剖位置，逐層關(guān)腹縫合［6］。對(duì)于Sham組，宮腔注入等量的生理鹽水。術(shù)后連續(xù)肌內(nèi)注射青霉素（80萬(wàn)U/只）3 d，預(yù)防感染。

Fig.1 The schematic diagram of uterine exposure and ligation in rats圖1 大鼠子宮暴露和結(jié)扎圖示

1.2.4 機(jī)械加載治療 2%異氟烷以1.0～1.5 L/min 的流速對(duì)TE+L組大鼠誘導(dǎo)麻醉后，采用本課題組自主研發(fā)的小動(dòng)物關(guān)節(jié)機(jī)械加載治療儀進(jìn)行治療。將大鼠膝關(guān)節(jié)外側(cè)、內(nèi)側(cè)置于加載桿和定子之間，加載力由外側(cè)向內(nèi)側(cè)施加到關(guān)節(jié)上，見(jiàn)圖2。加載頻率為15 Hz，力度為5 N，時(shí)間為5 min/d［5］，連續(xù)治療3個(gè)動(dòng)情周期即15 d。Sham組和TE組大鼠用相同的方法被麻醉和固定，但不接受機(jī)械加載治療。

Fig.2 The schematic diagram of mechanical loading for rats圖2 大鼠機(jī)械加載圖示

1.2.5 病理組織形態(tài)學(xué)觀測(cè) 3組動(dòng)物子宮組織取材后，標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，5μm組織切片。每只大鼠分別取3 張切片進(jìn)行常規(guī)HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜組織病理形態(tài)學(xué)改變，采用OLYMPUS cell Sens Standard 圖像處理軟件測(cè)定子宮內(nèi)膜厚度（子宮內(nèi)膜肌層交接處至宮腔的垂直距離）和子宮內(nèi)膜面積。此外，在40倍鏡下計(jì)數(shù)視野內(nèi)子宮內(nèi)膜腺體的數(shù)目。

1.2.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)子宮組織VEGF 和Ki-67 的表達(dá) 石蠟切片經(jīng)37 ℃烘片過(guò)夜，梯度乙醇水化，PBS 沖洗3 min×3次，微波抗原修復(fù)3 min×2次。每張切片滴加3%H2O2室溫孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次。封閉用血清工作液孵育15 min，甩去切片表面的封閉液（勿洗）。滴加稀釋好的一抗（VEGF和Ki-67稀釋濃度均是1∶200）4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗3 min×3 次。滴加二抗工作液孵育15 min，PBS 沖洗3 min×3次。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育15 min，PBS 沖洗 3 min×3 次，DAB 顯色，自來(lái)水沖洗 3 min。蘇木素復(fù)染15 min，PBS 返藍(lán)4 min，梯度乙醇水化，中性樹(shù)膠封片。VEGF 和Ki-67 蛋白表達(dá)分別位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，呈現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)400倍視野，計(jì)算視野內(nèi)VEGF 和Ki-67 陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)×100%，分別反映子宮內(nèi)膜血管生成和細(xì)胞增殖情況［7-8］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠動(dòng)情周期各階段的陰道涂片 動(dòng)情前期陰道涂片主要為圓形或橢圓形的有核上皮細(xì)胞，偶有少量角化上皮細(xì)胞；動(dòng)情期多為無(wú)核角化上皮細(xì)胞，外形不規(guī)則呈落葉狀聚集分布；動(dòng)情后期小而圓的白細(xì)胞開(kāi)始增多，有核上皮細(xì)胞和無(wú)核角化細(xì)胞同時(shí)存在，并且比例無(wú)明顯的差異；動(dòng)情間期陰道涂片的主要特征是白細(xì)胞，見(jiàn)圖3、4。

2.2 機(jī)械加載對(duì)子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)變化的影響 HE染色結(jié)果顯示，Sham組子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，呈波浪形，腺上皮及腔上皮細(xì)胞形態(tài)正常，排列緊密呈單層立方狀，間質(zhì)無(wú)水腫，血管和腺體正常。與Sham組相比，TE組子宮壁全層變薄，子宮內(nèi)膜層最顯著，宮腔內(nèi)可見(jiàn)脫落的組織碎片，子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)有缺失不連續(xù)，腺上皮及腔上皮細(xì)胞多呈現(xiàn)扁平狀，腺體明顯減少，間質(zhì)部分水腫，血管分布稀疏。經(jīng)過(guò)機(jī)械加載治療后，TE+L組子宮可見(jiàn)大部分完整宮腔結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜有一定的波浪形，大部分腺上皮及腔上皮細(xì)胞完整，分布均勻，排列緊密呈單層立方狀，腺體增多，血管分布密度集中，病理變化與TE組相比明顯改善，見(jiàn)圖5。

2.3 機(jī)械加載對(duì)子宮內(nèi)膜厚度、子宮內(nèi)膜面積和腺體數(shù)目的影響 與Sham組相比，TE組子宮內(nèi)膜明顯萎縮變薄，子宮內(nèi)膜面積減少，腺體數(shù)目顯著下降（均P＜0.05）。與TE組相比，TE+L組子宮內(nèi)膜的厚度明顯增厚，子宮內(nèi)膜面積增加，腺體數(shù)目顯著增多（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.4 機(jī)械加載對(duì)子宮內(nèi)膜中VEGF表達(dá)的影響 免疫組化VEGF染色結(jié)果顯示，VEGF主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中；與Sham組相比，TE組VEGF在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低（P＜0.05），經(jīng)機(jī)械加載治療后，TE+L組VEGF 在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率較TE組顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖6、表2。

Fig.5 Morphological changes of rat endometrium（HE staining）圖5 大鼠子宮內(nèi)膜的形態(tài)學(xué)變化（HE染色）

Tab.1 Comparison of endometrial thickness,endometrial area and gland number between three groups表1 各組子宮內(nèi)膜厚度、子宮內(nèi)膜面積和腺體數(shù)目的比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of endometrial thickness,endometrial area and gland number between three groups表1 各組子宮內(nèi)膜厚度、子宮內(nèi)膜面積和腺體數(shù)目的比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與TE組比較，P＜0.05

組別Sham組TE組TE+L組F子宮內(nèi)膜厚度（μm）535.84±61.23 245.13±51.62a 321.82±59.19ab 68.679＊子宮內(nèi)膜面積（mm2）1.78±0.48 0.76±0.19a 1.09±0.21ab 25.666＊腺體數(shù)目（個(gè)）20.10±6.21 4.50±1.27a 8.10±1.29ab 47.872＊

2.5 機(jī)械加載對(duì)子宮內(nèi)膜中Ki-67表達(dá)的影響 免疫組化Ki-67染色結(jié)果顯示，Ki-67主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞胞核中；與Sham組相比，TE組Ki-67 在腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低（P＜0.05）。經(jīng)機(jī)械加載治療后，TE+L組Ki-67 在腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率較TE組顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖7、表2。

Tab.2 Comparison of positive expressions of VEGF and Ki-67 in endometrium between three groups表2 各組子宮內(nèi)膜中VEGF和Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率的比較（n=10，%，±s）

Tab.2 Comparison of positive expressions of VEGF and Ki-67 in endometrium between three groups表2 各組子宮內(nèi)膜中VEGF和Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率的比較（n=10，%，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與TE組比較，P＜0.05

組別Sham組TE組TE+L組F VEGF 39.61±11.03 20.59±4.58a 27.63±5.42ab 16.125＊Ki-67 25.72±6.11 12.48±3.88a 18.43±3.83ab 19.643＊

3 討論

近年來(lái)，不孕癥已成為困擾女性生殖健康的世界性問(wèn)題，輔助生殖技術(shù)的迅速發(fā)展為解決這一難題提供了有效的途徑，但胚胎移植成功率仍限制在20%～30%。薄型子宮內(nèi)膜已經(jīng)成為體外受精-胚胎移植中周期取消和種植失敗的常見(jiàn)原因，直接導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降，影響臨床妊娠率［9］。目前，薄型子宮內(nèi)膜的常規(guī)治療方式是聯(lián)合用藥，但藥物治療存在較多的不良反應(yīng)，且患者的依從性較差［4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型，從運(yùn)動(dòng)康復(fù)的角度初步探討機(jī)械加載對(duì)薄型子宮內(nèi)膜的修復(fù)作用。

3.1 運(yùn)動(dòng)康復(fù)在女性生殖疾病中的運(yùn)用 物理康復(fù)訓(xùn)練是女性生殖系統(tǒng)疾病的重要治療手段。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能改善排卵功能異?；颊叩穆殉补δ埽{(diào)節(jié)雌孕激素水平，改善子宮微環(huán)境，有助于子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)［10］。此外，瑜伽運(yùn)動(dòng)能減少子宮血流血管的阻力，增加子宮血液灌注，改善子宮缺血的狀態(tài)，從而減輕痛經(jīng)癥狀［11］。脈沖式機(jī)械加載作為一種模擬人體主動(dòng)運(yùn)動(dòng)的新型物理康復(fù)治療方式，以一定頻率對(duì)滑膜關(guān)節(jié)進(jìn)行機(jī)械刺激從而產(chǎn)生治療作用。研究表明，機(jī)械加載可以刺激血管生成，抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分化功能［12-13］。與傳統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)康復(fù)訓(xùn)練相比，其能夠更好地幫助身體殘疾或制動(dòng)的患者進(jìn)行主動(dòng)物理運(yùn)動(dòng)，達(dá)到治療的作用。

3.2 機(jī)械加載對(duì)薄型子宮內(nèi)膜的療效 本研究采用95%乙醇宮腔內(nèi)注射能較好地復(fù)制薄型子宮內(nèi)膜模型。造模后大鼠子宮內(nèi)膜損傷明顯，子宮內(nèi)膜層萎縮變薄，內(nèi)膜面積縮小，腺體數(shù)量減少，血管分布稀疏，間質(zhì)部分水腫，宮腔失去原有完整結(jié)構(gòu)，與之前Jang 等［14］研究結(jié)果基本一致。不同之處在于，本實(shí)驗(yàn)采用許春燕等［6］的改良方法進(jìn)行造模，將血管夾替換成壓強(qiáng)較小的0號(hào)絲線進(jìn)行活結(jié)結(jié)扎子宮兩端，避免了對(duì)子宮的強(qiáng)烈刺激，減少實(shí)驗(yàn)誤差，使其符合臨床相關(guān)癥狀。本研究結(jié)果顯示，施加機(jī)械加載干預(yù)后，能明顯增加薄型子宮內(nèi)膜的厚度，增加內(nèi)膜面積，恢復(fù)腔上皮和腺上皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)，減輕間質(zhì)水腫，促進(jìn)內(nèi)膜腺體和毛細(xì)血管的生成，提示機(jī)械加載能夠改善子宮內(nèi)膜組織的病理?yè)p傷，緩解薄型子宮內(nèi)膜的病程發(fā)展。

3.3 機(jī)械加載對(duì)血管生成和細(xì)胞增殖的作用 子宮內(nèi)膜的血管生成和細(xì)胞增殖相互依賴、互相促進(jìn)，是子宮內(nèi)膜有效修復(fù)再生、為胚胎植入提供良好子宮內(nèi)膜微環(huán)境的兩個(gè)關(guān)鍵性因素。VEGF 被認(rèn)為是調(diào)控子宮內(nèi)膜新生血管形成的重要因子，可增加子宮內(nèi)膜血管通透性及血管化，通過(guò)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜微環(huán)境促進(jìn)胚胎植入［15］。VEGF 與薄型子宮內(nèi)膜關(guān)系密切，VEGF 低表達(dá)會(huì)抑制血管的生成，子宮內(nèi)膜血供減少，影響子宮內(nèi)膜的增殖和修復(fù)，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性降低［3］。本研究結(jié)果顯示，與Sham組相比，TE組的VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低；經(jīng)過(guò)機(jī)械加載治療后，TE+L組的VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于TE組，提示機(jī)械加載通過(guò)上調(diào)VEGF 的表達(dá)促進(jìn)血管生成，增加子宮血液灌注，促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生。Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，被認(rèn)為是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志物，能夠客觀地反映出子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的程度［16］。本研究結(jié)果顯示，TE+L組Ki-67 陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于TE組，提示機(jī)械加載能通過(guò)上調(diào)Ki-67 的表達(dá)促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖，修復(fù)損傷的子宮內(nèi)膜組織。以上結(jié)果表明機(jī)械加載可能通過(guò)促進(jìn)子宮內(nèi)膜的血管生成和細(xì)胞增殖，從而修復(fù)薄型子宮內(nèi)膜，但其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

3.4 不足與展望 既往治療薄型子宮內(nèi)膜的藥物作用有限，效果不確切。因此，找到一種安全有效的治療方式是目前面臨的一大挑戰(zhàn)。本研究結(jié)果表明，機(jī)械加載對(duì)大鼠薄型子宮內(nèi)膜有明顯修復(fù)作用，該作用可能與機(jī)械加載促進(jìn)子宮內(nèi)膜的細(xì)胞增殖和血管生成有關(guān)。這一研究為機(jī)械加載的物理康復(fù)治療和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，機(jī)械加載治療薄型子宮內(nèi)膜的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

Fig.3 Pictures showing unstained vaginal smear at different stages of estrous cycle in rats(×200)圖3 大鼠動(dòng)情周期各階段的未染色陰道涂片（×200）

Fig.4 Pictures showing stained vaginal smear at different stages of estrous cycle in rats(HE staining，×200)圖4 大鼠動(dòng)情周期各階段的染色陰道涂片（HE染色，×200）

Fig.6 The expression of VEGF in rat endometrium(immunohistochemistry staining，×400)圖6 大鼠子宮內(nèi)膜VEGF的表達(dá)（免疫組化染色，×400）

Fig.7 The expression of Ki-67 in rat endometrium(immunohistochemistry staining，×400)圖7 大鼠子宮內(nèi)膜Ki-67的表達(dá)（免疫組化染色，×400）