PDCD4表達(dá)下調(diào)通過pAKT/pGSK3β途徑促進(jìn)胃癌順鉑耐藥的機制初探

柳丹，湯志明，武福云，趙紅艷，柯鏡，向鵬，金佳晴，李珊，2△

胃癌是世界上死亡率排名第三的常見消化道惡性腫瘤［1］，順鉑（cisplatin，DDP）是目前臨床上使用的最重要的抗癌藥物之一［2-3］。但是，胃癌細(xì)胞對DDP耐藥性的產(chǎn)生?？芍禄熓。?］。因此，如何提高胃癌細(xì)胞對DDP 的敏感度、避免化療耐藥性的產(chǎn)生是目前臨床上亟待解決的問題。程序性細(xì)胞凋亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類促凋亡基因，筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PDCD4能夠通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)起到促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用［5］。另有研究發(fā)現(xiàn)，PDCD4 水平和腫瘤化療敏感度有關(guān)［6］。但關(guān)于PDCD4對胃癌細(xì)胞DDP敏感性的影響尚未明確，而PDCD4 的下游調(diào)控基因也未完全闡明。本研究通過敲低PDCD4表達(dá)水平，探究其是否通過磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylated protein kinase B，pPKB/pAKT）/磷酸化糖原合成酶激酶 3β（phosphorylated glycogen synthase kinase3β，pGSK3β）信號通路對胃癌細(xì)胞DDP耐藥產(chǎn)生影響，以期為胃癌DDP耐藥機制的闡明尋找新的分子靶點，也為診斷胃癌DDP 敏感性提供潛在的標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 主要材料 胃癌細(xì)胞系SGC-7901 購自中科院上海細(xì)胞所；胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；青鏈霉素雙抗購自杭州吉諾公司；抗PDCD4 多克隆抗體（66100）、pAKT（S473）單克隆抗體（66444）聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（剪切體）［poly ADP-ribose polymerase cleavage，PARP（C）］抗體（13371）購自武漢三鷹技術(shù)有限公司，抗pGSK3β（S9）抗體（5558）購自美國CST公司；LY294002（S1737）、wortmannin（S1952）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司；Caspase 3活性檢測試劑盒購自上海貝博公司；M-PER、蛋白酶抑制劑、BCA 檢測試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將胃癌細(xì)胞株SGC-7901 培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基，5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。shRNA 購自上海吉瑪公司，shRNA 序列：shRNA scramble control（shNC）5'-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3'；shPDCD4 5'-CTGGACAGGTGTATGATGTGG-3' 。 按 照lipofectamine 3000 說明書（Invitrogen，美國）將ShNC 和Sh-PDCD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞系，再經(jīng)過G418篩選14 d培養(yǎng)陽性克隆，得到穩(wěn)定敲減表達(dá)的細(xì)胞系。在2種細(xì)胞株中分別通過熒光顯微鏡檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，利用Realtime RT-PCR 和 Western blot 檢測 PDCD4 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。將細(xì)胞分為sh-NC組（僅穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shNC 質(zhì)粒）；shPDCD4組（僅穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shPDCD4質(zhì)粒）；shNC加藥組（轉(zhuǎn)染shNC 質(zhì)粒并加入 2.5 mg/L 順鉑處理 12 h）；shPDCD4 加藥組（轉(zhuǎn)染shPDCD4 質(zhì)粒并加入順鉑處理）。為了探究Akt 的作用，在細(xì)胞中加入特異性Akt抑制劑LY294002和Wortmannin阻斷信號通路12 h，將細(xì)胞分為LY294002 阻斷組（轉(zhuǎn)染shPDCD4質(zhì)粒，10μmol LY294002預(yù)處理12 h再加入順鉑處理）、Wortmannin 阻斷組（轉(zhuǎn)染shPDCD4 質(zhì)粒，先加5 μmol Wortmannin預(yù)處理4 h再加入順鉑處理）。

1.3 熒光定量PCR 檢測PDCD4 mRNA 表達(dá)情況 細(xì)胞總RNA的抽提采用TRIzol 法。取2μg總RNA采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Bio-Rad 熒光定量PCR 儀，SYBR Green實時熒光定量PCR檢測目的基因mRNA的表達(dá)。所用引物見文獻(xiàn)［5］。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，并進(jìn)行熔解曲線分析。GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法分析目的基因的相對表達(dá)水平。

1.4 Western blot 印跡法檢測PDCD4、pAKT、pGSK3β、PARP（C）蛋白表達(dá)情況 用含cocktail 蛋白酶抑制劑的M-PER 裂解液200μL裂解細(xì)胞30 min，所有操作均在冰上進(jìn)行。離心收集上層液體。取部分樣品進(jìn)行BCA 法定量分析并調(diào)整上樣量至 20 μg。SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉，加 PDCD4、pAKT、pGSK3β、PARP（C）與內(nèi)參蛋白GAPDH 一抗（1∶1 000稀釋），4 ℃環(huán)境下孵育過夜，TBST洗滌后HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒化學(xué)發(fā)光液與PVDF 膜反應(yīng)，曝光并保存圖片。采用圖像分析軟件Image J 對Western blot 實驗所得結(jié)果圖像進(jìn)行灰度分析，所有結(jié)果以GAPDH 為內(nèi)參對照，結(jié)果用灰度比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 Caspase 3活性檢測 采用Caspase 3酶活性的試劑盒結(jié)合分光光度法檢測細(xì)胞裂解液中Caspase 3 酶活性。操作步驟參照試劑盒說明書。將細(xì)胞鋪入96孔板，胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，PBS 洗滌1次后加入裂解液，冰浴裂解15 min。每孔中加入底物10μL，37 ℃孵育2 h后于405 nm處檢測光密度（OD）值。

1.6 免疫熒光檢測細(xì)胞凋亡變化 分組處理結(jié)束后收集細(xì)胞，吸盡培養(yǎng)液，加入固定液，固定10 min或4 ℃過夜。細(xì)胞培養(yǎng)物中加入約1/10 細(xì)胞培養(yǎng)基體積Hoechst 染色液，充分覆蓋待染色的樣品。在37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞10～20 min。PBS洗細(xì)胞2次。將樣本置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)變化，若有細(xì)胞核不完整、核固縮、染色質(zhì)聚集濃染等現(xiàn)象出現(xiàn)，表示細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件作統(tǒng)計學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用析因設(shè)計2因素2水平的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDCD4 穩(wěn)定敲低表達(dá)的SGC-7901 細(xì)胞株構(gòu)建 熒光顯微鏡下可見多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，見圖1。不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和是否加順鉑干預(yù)對PDCD4 的mRNA 及蛋白相對表達(dá)水平存在交互作用（P＜0.05）；各單獨效應(yīng)下，shPDCD4組較shNC組PDCD4 的mRNA 和蛋白相對表達(dá)水平明顯降低；shPDCD4加藥組較shNC加藥組 PDCD4 的mRNA 和蛋白相對表達(dá)水平也顯著減弱（均P＜0.05），見圖2、表1。

2.2 各組 Caspase3 活性比較 shNC組、shPDCD4組、shNC 加藥組、shPDCD4 加藥組 Caspase3 活性水平分別為0.039±0.016、0.037±0.011、0.263±0.024、0.216±0.014（n=3，F(xiàn)A=424.674，F(xiàn)B=6.183，F(xiàn)A×B=5.376，均P＜0.05），其中與shNC 加藥組相比，shPDCD4 加藥組Caspase3活性下降（P＜0.05）。

Fig.1 Transfection effect detected by fluorescence microscope（×200）Fig.1 熒光顯微鏡檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況（×200）

Fig.2 Western blot analysis of PDCD4 protein level in deficiency stable cell line of SGC-7901圖2 Western blot 檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞株中PDCD4的表達(dá)

Tab.1 Relative mRNA and protein expression levels of PDCD4 after SGC-7901 cell transfection表1 SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PDCD4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況 （n=3，±s）

Tab.1 Relative mRNA and protein expression levels of PDCD4 after SGC-7901 cell transfection表1 SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PDCD4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；A:不同轉(zhuǎn)染質(zhì)粒影響；B：是否加順鉑

組別shNC組shPDCD4組shNC加藥組shPDCD4加藥組PDCD4 蛋白1.02±0.21 0.37±0.04 0.65±0.12 0.41±0.08 36.331＊＊5.291＊7.628＊FA FB FA×B PDCD4 mRNA 1.08±0.08 0.57±0.09 1.32±0.11 0.47±0.09 158.303＊＊1.761 9.681＊

2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測各組細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞經(jīng)過加入Hochest 染料后檢測發(fā)現(xiàn)，shNC 加藥組細(xì)胞數(shù)目明顯降低，并且一部分細(xì)胞核結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不完整、核固縮、染色質(zhì)聚集濃染等現(xiàn)象，而shPDCD4加藥組中細(xì)胞數(shù)目也有減少，但細(xì)胞核形態(tài)未發(fā)生顯著改變，見圖3。

Fig.3 PDCD4 deficiency inhibited apoptosis induced by DDP in gastric cancer cells（×400）圖3 PDCD4表達(dá)缺失抑制DDP引起的胃癌細(xì)胞凋亡（×400）

2.4 各組PDCD4 表達(dá)下調(diào)后相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 （1）pAKT 和pGSK3β。不同質(zhì)粒與加藥間對pAKT 和pGSK3β 蛋白的相對表達(dá)水平存在交互作用（P＜0.05）；各單獨效應(yīng)下，相較于 shNC組，shPDCD4組中 pAKT 和 pGSK3β 的表達(dá)量均有明顯增加，而與shNC加藥組相比，shPDCD4加藥組pAKT和pGSK3β 的蛋白表達(dá)水平有顯著上調(diào)（均P＜0.05），見圖4、表2。（2）PARP（C）、p-GSK3β 及pAKT。不同質(zhì)粒與加藥對PARP（C）、p-GSK3β 及pAKT蛋白的相對表達(dá)水平存在交互作用；各單獨效應(yīng)下，相較于shPDCD4 加藥組，Wortmannin 阻斷組PARP（C）的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，p-GSK3β 和pAKT蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）；相較于shPDCD4加藥組，LY294002 阻斷組PARP（C）的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，p-GSK3β 和 pAKT 蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05），見圖5、表3。

Fig.4 PDCD4 knockdown induced the increased levels of pAkt and phosphorylation of GSK3β圖4 PDCD4表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致pAKT表達(dá)升高，GSK3β磷酸化發(fā)生

Tab.2 The relative expression of target protein after PDCD4 knockdown表2 PDCD4表達(dá)下調(diào)后目的蛋白的相對表達(dá)量

Fig.5 PDCD4 knockdown inhibited apoptosis through pAKT/pGSK3β pathway圖5 PDCD4表達(dá)下調(diào)通過pAKT/pGSK3β途徑抑制細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)

3 討論

PDCD4蛋白包含兩個重要的α-螺旋，能夠競爭性地結(jié)合于真核細(xì)胞翻譯起始因子上，從而抑制真核生物蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7］。研究表明，PDCD4 在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)出低表達(dá)，而正常表達(dá)或高表達(dá)PDCD4 則可通過抑制基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［8］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PDCD4將導(dǎo)致抗凋亡蛋白的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生［5］。Caspase 3是一個在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的關(guān)鍵蛋白酶。Caspase 3 可以直接特異性剪切許多Caspase 底物，是細(xì)胞凋亡分子機制的重要組成部分［9］。本研究細(xì)胞免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低表達(dá)PDCD4將導(dǎo)致DDP引起的細(xì)胞凋亡水平下降，表明PDCD4的表達(dá)下調(diào)可降低細(xì)胞對DDP的敏感性，提示著PDCD4可能通過某些信號途徑調(diào)控DDP引起的細(xì)胞凋亡。

Tab.3 The relative expression of target protein after inhibiting Akt pathway表3 Akt通路阻斷后目的蛋白的相對表達(dá)量

細(xì)胞凋亡是一個涉及多條信號通路、調(diào)控精細(xì)復(fù)雜的過程。Akt是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，Akt的活化（pAKT）是Akt 信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用的關(guān)鍵。GSK3β 是Akt 活化后的下游靶基因之一，除了可以調(diào)控糖代謝，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GSK3β還可通過磷酸化信號通路蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，從而影響細(xì)胞的生存與凋亡［10］。已經(jīng)有研究表明 pAKT/pGSK3β 信號通路與腫瘤細(xì)胞的增殖、生存、凋亡、代謝、侵襲轉(zhuǎn)移，以及腫瘤耐藥、腫瘤免疫逃逸等密切相關(guān)［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于shNC組，shPDCD4組中pAKT和pGSK3β 的表達(dá)量均有明顯增加，而與shNC 加藥組相比，shPDCD4加藥組pAKT和pGSK3β的蛋白表達(dá)水平仍有顯著上調(diào)，表明敲減PDCD4的表達(dá)可增加pAKT和pGSK3β的蛋白表達(dá)水平，提示PDCD4表達(dá)缺失能夠激活pAKT/pGSK3β信號通路，推斷PDCD4表達(dá)缺失抑制細(xì)胞凋亡可能是通過激活pAKT/pGSK3β信號通路來實現(xiàn)。

當(dāng) Akt 被激活以后，GSK3β N 末端絲氨酸殘基（Ser9-GSK3β）的磷酸化可促進(jìn)GSK3β的降解，進(jìn)一步抑制了其本身作為激酶的活性［12］，能夠促進(jìn)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡［9］。一旦GSK3β 被磷酸化后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性凋亡出現(xiàn)下降，從而利于腫瘤細(xì)胞的存活，因此，GSK3β磷酸化增強有利于腫瘤耐藥的發(fā)生。有研究表明，卵巢癌細(xì)胞對DDP 耐藥與pAKT［13］和pGSK3β［14］的活化有密切關(guān)系。而且在乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞系中，pGSK3β增加可阻礙細(xì)胞的凋亡通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥［15］。本研究顯示，相較于shPDCD4加藥組，Wortmannin 阻斷組PARP（C）的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，p-GSK3β和pAKT蛋白表達(dá)水平下調(diào)；相較于shPDCD4加藥組，LY294002阻斷組PARP（C）的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，p-GSK3β 和pAKT 蛋白表達(dá)水平下降，表明當(dāng)在PDCD4 表達(dá)缺失的細(xì)胞中加入兩種Akt 抑制劑阻斷該信號通路后，凋亡標(biāo)志蛋白PARP（C）的表達(dá)均重新出現(xiàn)上調(diào)趨勢，提示PDCD4 表達(dá)缺失所抑制的細(xì)胞凋亡依賴于pAKT/pGSK3β 信號通路的活化。

綜上所述，PDCD4 在腫瘤中表達(dá)下調(diào)或者缺失可激活pAKT/pGSK3β信號通路，從而引起腫瘤耐藥的發(fā)生發(fā)展。PDCD4可作為抑癌基因，一旦在胃癌細(xì)胞中表達(dá)缺失，將導(dǎo)致胃癌細(xì)胞對化療藥物DDP的敏感性下降，促進(jìn)細(xì)胞耐藥的發(fā)生，這將為胃癌的耐藥機制探討提供新的思路與方法，有望為臨床上DDP耐藥敏感性判斷提供新的分子靶標(biāo)。