黃連素在脊髓損傷中對線粒體的保護作用及機制

王 奕，于榮華，徐 煒，朱曉東，林浩東*

1.海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院骨科，上海 200003

2.上海市交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院骨科，上海 200050

脊髓損傷（SCI）是骨科、神經(jīng)科的嚴重疾病之一，常導致完全或不完全性的感覺、運動以及自主神經(jīng)功能障礙等［1-2］，嚴重威脅患者的健康和生命［2-3］。SCI具有十分復雜的病理生理過程，主要分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷指外力導致的直接性破壞，通常是不可逆的［4］。而繼發(fā)性損傷是導致SCI后病理級聯(lián)反應的主要組成部分，是可逆的，因此，目前的研究多集中在繼發(fā)性損傷方面。繼發(fā)性損傷包括炎性反應、Ca2+超載、氧化應激、興奮性氨基酸釋放、線粒體應激等一系列病理過程，最終導致神經(jīng)元、膠質細胞凋亡，引發(fā)運動和感覺障礙［5］。線粒體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種疾病中扮演著非常重要的角色，通過干預線粒體氧化損傷以抑制SCI后細胞凋亡、促進神經(jīng)功能恢復已經(jīng)成為研究前沿與熱點。

黃連素（小檗堿）是從中國傳統(tǒng)中藥黃連中提取的一種天然的異喹啉類生物堿，具有抗炎、抗菌、抗癌及降糖等多種藥理作用［6-7］。近年來，黃連素在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用日益被重視。研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可保護運動神經(jīng)元［8］，對神經(jīng)退行性病變具有潛在治療作用［9］，并且可減輕腦缺血再灌注損傷［10］。與此同時，有研究證實黃連素具有抗氧化應激、保護線粒體的作用，Zhang等［11］通過體外實驗證明黃連素可以保護干細胞，降低低氧誘導的細胞凋亡率；Gomes等［12］發(fā)現(xiàn)黃連素可以介導SIRT1依賴的線粒體途徑減輕胰島素抵抗。本研究旨在通過測定黃連素對SCI后線粒體氧化和神經(jīng)細胞凋亡的影響，研究黃連素對SCI的可能作用與機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

黃連素購自Sigma-Aldrich公司；PSI-IH脊髓打擊器購自新澤西州立大學；丙二醛（MDA）試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液（強）、線粒體和胞質蛋白制備試劑盒購自碧云天生物技術研究所；細胞色素C（Cyt C）單克隆抗體（ab110325，1∶1 000稀釋）、羊抗兔IgG-HRP抗體（ab6721，1∶2 000稀釋）、羊抗鼠IgG-HRP抗體（ab6789，1∶2 000稀釋）、NeuN單克隆抗體（ab177487，1∶1 000稀釋）、FITC標記的羊抗兔IgG（ab6717，1∶500稀釋）購自Abcam公司；caspase-3單克隆抗體（9661s，1∶1 000稀釋）、cleaved capase-3單克隆抗體（8172S，1∶1000稀釋）、β-actin單克隆抗體（4970S，1∶1 000稀釋）購自CST公司；TUNEL染色試劑盒（In Situ Cell Death Detection Kit，TMR red；12156792910）購自Roche公司。全自動酶標儀和電泳儀購自Bio-Rad公司；-80℃超低溫冰箱購自Thermo公司；高速冷凍離心機購自Eppendorf公司；冰凍切片機購自Leica公司；熒光顯微鏡購自Olympus集團。

1.2 SCI模型制備與動物分組

SPF級健康雄性C57小鼠36只（上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院實驗動物中心），體質量250 ～300 g，采用隨機數(shù)字表法平均分為3組（n=12），即假手術組、SCI組、黃連素組。假手術組僅去除椎板和棘突顯露脊髓，不進行造模打擊；SCI組、黃連素組使用PSI-IH脊髓打擊器制備SCI模型［13］，打擊點T10，損傷力為0.6 N，停留時間為0 s。模型成功標準：脊髓充血，雙下肢痙攣抽動，尾巴痙攣擺動，BBB評分為0分。模型制備成功后立即經(jīng)腹腔注射給藥一次，劑量為10 mg/kg（根據(jù)前期預實驗結果及參考文獻［14］方法確定，SCI組注射生理鹽水，黃連素組注射黃連素）。術后小鼠自由進食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境室溫維持在23℃ ～ 25℃，保持干燥通風。協(xié)助SCI小鼠排尿、排便，每日3次。

1.3 小鼠脊髓組織線粒體GSH、MDA、SOD的檢測

各組小鼠于SCI后24 h麻醉，迅速取出以打擊點為中心、頭尾端各0.5 cm（共計1.0 cm）的脊髓組織，進行生物化學檢測和蛋白質印跡分析。取脊髓組織，剪碎、勻漿，根據(jù)線粒體和胞質蛋白制備試劑盒說明進行操作，分離線粒體和胞質蛋白。取提純的線粒體，按照GSH、MDA、SOD試劑盒說明書進行操作，使用全自動酶標儀進行檢測，最后根據(jù)BCA法測得的線粒體蛋白濃度進行換算，得出各組線粒體中GSH、MDA、SOD的水平。

1.4 小鼠脊髓組織caspase-3、cleaved caspase-3以及細胞質內(nèi)和線粒體內(nèi)Cyt C的檢測

取相應的脊髓組織、胞質蛋白或提純的線粒體，制備蛋白樣品，進行凝膠電泳。電泳完畢后將蛋白轉移至PVDF膜上，將轉印后的PVDF膜置于封閉液中室溫下?lián)u床封閉1 h。根據(jù)檢測蛋白所在區(qū)域裁剪PVDF膜，分別置于caspase-3一抗（1∶1 000稀釋）、cleaved caspase-3一抗（1∶1 000稀釋）、Cyt C一抗（1∶1 000稀釋）和β-actin一抗（1∶1 000稀釋）中，4℃搖床孵育過夜。用TBST室溫洗膜3次，將膜置于山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG二抗（1∶2 000稀釋）中，室溫搖床孵育1 h。取出后再用TBST洗膜3次。將超敏ECL試劑盒中A液和B液等體積混合后滴加于PVDF膜上，利用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，保存蛋白圖像，利用Image J軟件對蛋白圖像進行分析。

1.5 脊髓組織中神經(jīng)細胞凋亡的檢測

SCI后24 h麻醉小鼠，仰臥位胸部備皮，打開胸腔暴露心臟，迅速將細針刺入小鼠主動脈，用止血鉗固定，連接恒流泵進行灌注。灌注50 mL生理鹽水后，再低速灌注4%多聚甲醛溶液20 min。灌注完成后立即取出以打擊點為中心、頭尾端各0.5 cm（共計1.0 cm）的脊髓組織，用4%多聚甲醛浸泡固定24 h，20%、30%蔗糖溶液梯度脫水各24 h。脫水完畢后，在-20℃環(huán)境中用OCT包埋劑包埋脊髓組織。使用冰凍切片機在-20℃條件下連續(xù)切取脊髓冠狀面組織切片，切片厚度為5 μm。從打擊中心開始，頭尾端每隔3張切片取1張，每個組織共取6張切片，將組織切片貼附于載玻片上，放入冰箱中以備免疫熒光染色檢測。

取出制備好的切片，復溫后用PBS浸洗3次，加正常驢血清封閉1 h。將一抗NeuN（1∶1 000稀釋）滴加到切片上，4℃避光孵育過夜，用PBS浸洗3次。加入FITC標記的羊抗兔IgG（1∶500稀釋），室溫避光孵育1 h，用PBS浸洗3次。按照TUNEL染色試劑盒說明書進行操作。最后每張組織切片滴加30 μL的DAPI溶液（2 μg/mL），避光、室溫孵育3 min。在200倍視野下，每張切片隨機選取6個視野，觀察計數(shù)綠色熒光的NeuN標記與紅色的凋亡小體標記共同定位的TUNEL陽性細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)均采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠SCI模型的可重復性和標準性

采用PSI-IH脊髓打擊器制備小鼠SCI模型，全程計算機控制，打擊脊髓后小鼠雙后肢迅速出現(xiàn)痙攣性抽搐，尾巴翹起并左右搖擺，隨后出現(xiàn)雙后肢肌力喪失，銳器刺激雙下肢無反應，喪失自主排尿能力。通過IH Spinal Cord Impactor Software V5.0.4軟件瞬間獲得脊髓受打擊時的所有信息，如位移/打擊力曲線、設定力大小、實際撞擊力大小、脊髓位移等，各實驗動物SCI模型曲線一致。同時分析各實驗動物實際打擊力量，符合正態(tài)分布［打擊力為（0.581 67±0.049 97）N］，說明SCI模型具有良好的穩(wěn)定性和適用性。

2.2 各組小鼠脊髓組織線粒體中MDA、GSH、SOD水平

與假手術組相比，SCI組、黃連素組小鼠脊髓組織MDA水平增高，GSH、SOD水平降低；與SCI組相比，黃連素組小鼠脊髓組織MDA水平降低，GSH、SOD水平增高；差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05，圖1）。

2.3 各組小鼠脊髓組織線粒體和細胞質內(nèi)Cyt C表達水平

與假手術組相比，SCI組、黃連素組小鼠脊髓組織線粒體中Cyt C表達量減少，細胞質內(nèi)Cyt C表達量增多；與SCI組相比，黃連素組小鼠脊髓組織線粒體中Cyt C表達量增多，細胞質內(nèi)Cyt C表達量減少；差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05，圖2）。

圖1 各組小鼠脊髓組織線粒體內(nèi)MDA、GSH和SOD水平Fig. 1 Levels of MDA，GSH and SOD in mitochondria of each group

圖2 各組小鼠脊髓組織中線粒體和細胞質內(nèi)Cyt C水平Fig. 2 Levels of Cyt C in mitochondria and cytoplasm of each group

2.4 各組小鼠脊髓組織中caspase-3、cleaved caspase-3表達水平

SCI組小鼠脊髓組織中凋亡關鍵分子caspase-3的表達量較假手術組增多（P ＜ 0.05）；黃連素組caspase-3表達量與SCI組相比降低（P ＜ 0.05），與假手術組相比增高（P ＜ 0.05）。各組cleaved caspase-3表達趨勢與caspase-3一致。見圖3。

與假手術組相比，SCI組、黃連素組小鼠脊髓組織中caspase-3、cleaved caspase-3表達水平增高；與SCI組相比，黃連素組小鼠脊髓組織中caspase-3、cleaved caspase-3表達水平降低；差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠脊髓組織中caspase-3和cleaved caspase-3表達量Fig. 3 Expressions of caspase-3 and cleaved caspase-3 in each group

2.5 神經(jīng)元凋亡免疫熒光雙標記染色

圖4a中藍色熒光的DAPI標記細胞核，綠色熒光的NeuN標記神經(jīng)細胞，紅色熒光的TUNEL法標記凋亡小體，綠色與紅色熒光共同定位的細胞為凋亡神經(jīng)細胞。與假手術組相比，SCI組與黃連素組小鼠脊髓組織中神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量增多；與SCI組相比，黃連素組神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量減少；差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05，圖4b）。

3 討 論

圖4 各組小鼠脊髓組織中神經(jīng)元凋亡情況Fig. 4 Neural apoptosis in each group

近年研究表明，SCI后脊髓神經(jīng)元的死亡和缺失主要是由細胞凋亡導致，并非緣于原發(fā)性直接損傷，因此，如何有效抑制SCI后細胞凋亡是預防或減輕繼發(fā)損傷、促進相關功能恢復的關鍵。細胞凋亡是在生理或病理情況下，細胞主動激活并按照特定方式進行的一種由遺傳信息調(diào)控的細胞死亡途徑，與繼發(fā)性SCI的重要環(huán)節(jié)——氧化應激密切相關。SCI后體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，內(nèi)環(huán)境更傾向于氧化狀態(tài)，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，超過機體的清除能力，導致組織中的氧自由基大量堆積，使包括線粒體膜在內(nèi)的各種生物膜性結構完整性及通透性遭到破壞，多種細胞器功能異常，產(chǎn)生更多的氧自由基，形成氧化應激惡性循環(huán)［15］，對能量代謝豐富的脊髓組織中線粒體損傷極為顯著。

線粒體損傷會導致脂質過氧化物積聚。本研究選取MDA、GSH、SOD作為檢測氧化損傷的指標。MDA是一種脂質過氧化的終產(chǎn)物，是常用的反映組織氧化損傷程度的指標；GSH作為一種脂質過氧化物清除劑，其含量是衡量機體抗氧化能力的重要標準；SOD是機體內(nèi)清除氧自由基的重要保護性物質，是反映機體抗氧化能力的經(jīng)典指標。本研究發(fā)現(xiàn)，SCI后脊髓組織線粒體中MDA水平升高，SOD、GSH水平降低，說明SCI可以誘導氧化損傷和線粒體損傷，與本研究預實驗及其他研究相符［15-16］。而在SCI模型建立后24 h，應用黃連素能明顯抑制線粒體MDA的產(chǎn)生，同時促進SOD、GSH的產(chǎn)生，說明黃連素能夠抑制SCI后線粒體的氧化應激反應，對線粒體起到保護作用。此外，Hsu等［8］發(fā)現(xiàn)黃連素通過抗氧化損傷和PI3K/Akt通路發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用。Yu等［17］證實黃連素可以通過保護線粒體減輕腎小管細胞的低氧再灌注損傷。Yan等［6］證實黃連素與線粒體存在密切關系。在腫瘤細胞中，中毒劑量的黃連素可以抑制線粒體的功能，從而抑制腫瘤細胞的增殖，說明線粒體可能是黃連素的藥理作用靶點之一。

線粒體氧化應激反應可以激活線粒體凋亡通路，從而導致神經(jīng)元的缺失。Cyt C是生物氧化過程中的重要電子傳遞體，其對組織的氧化、還原有迅速的酶促作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，Cyt C通常定位于神經(jīng)細胞線粒體內(nèi)，參與氧化呼吸鏈反應，為細胞供給能量。但在氧化應激、炎癥等損傷情況下，線粒體膜結構發(fā)生破壞，Cyt C從線粒體釋放到細胞質中，與一系列凋亡因子或蛋白相互作用，最終導致細胞凋亡關鍵執(zhí)行者caspase-3激活為cleaved caspase-3，從而介導caspase家族依賴性細胞凋亡途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，SCI后脊髓組織細胞線粒體內(nèi)Cyt C降低，釋放進入細胞質。結合生物化學的檢測結果，印證了SCI可以介導線粒體氧化應激、促進Cyt C的釋放。注射黃連素后Cyt C從線粒體中的釋放減少，說明黃連素可以通過抗氧化損傷保護線粒體。本研究進一步檢測了各組小鼠脊髓組織內(nèi)caspase-3及cleaved caspase-3的表達水平，發(fā)現(xiàn)SCI引起caspase-3、cleaved caspase-3表達升高，激活凋亡途徑，而黃連素可以抑制caspase凋亡途徑。因此，推測黃連素可能通過抗氧化損傷及抑制線粒體凋亡通路保護線粒體，在SCI中起到神經(jīng)保護作用。

由于脊髓組織中存在神經(jīng)細胞、膠質細胞等多種細胞，為了進一步明確黃連素對神經(jīng)元的作用并排除其他細胞的影響，本研究采用免疫熒光雙標染色，分別選取了細胞核標記物DAPI、神經(jīng)元特異性標記物NeuN和TUNEL法進行共染色，結果顯示，與SCI組相比，黃連素組神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量減少，說明黃連素可以保護SCI后脊髓神經(jīng)元、抑制神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，黃連素可減輕SCI小鼠脊髓組織中神經(jīng)細胞凋亡，這可能與其抑制線粒體氧化損傷、減少Cyt C釋放、降低凋亡蛋白表達有關。黃連素作為傳統(tǒng)中藥的主要成分，其作用與機制是多方面的。Yu等［17］發(fā)現(xiàn)黃連素對于腎小管缺氧損傷的保護作用一方面來源于保護線粒體，另一方面與抑制內(nèi)質網(wǎng)應激也密切相關。Hsu等［8］指出黃連素的神經(jīng)保護功能與激活Nrf2核轉移以及PI3K/Akt通路相關，此外，抗氧化損傷和抑制相關凋亡蛋白表達也是黃連素在神經(jīng)系統(tǒng)中的可能機制之一。Lu等［18］發(fā)現(xiàn)黃連素可能通過激活AMPK通路、減少能量儲備而抑制神經(jīng)軸突的生長。因此，雖然本研究從細胞器水平、線粒體方面解讀了黃連素對于SCI的作用，但其在神經(jīng)等系統(tǒng)中的機制尚有待進一步研究。