急性脊髓損傷患者血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究

高 瑞，楊成偉，王偉恒，周許輝

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院骨科，上海 200003

急性脊髓損傷（SCI）是脊柱外科的常見疾病之一［1］。目前尚缺乏有效、特異性的實(shí)驗(yàn)室檢查手段或評(píng)估指標(biāo)。SCI后的病理過(guò)程可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷是指椎體或椎間盤等對(duì)脊髓造成的直接壓迫，繼發(fā)性損傷是指在原發(fā)性損傷后脊髓出現(xiàn)出血和炎性反應(yīng)［2］。目前脊髓繼發(fā)性損傷的病理生理機(jī)制和生物化學(xué)通路尚未完全明確［3］。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種疾病的標(biāo)志物檢測(cè)研究，本研究采用非標(biāo)記相對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)（labelfree）技術(shù)比較急性頸部SCI患者和健康人群血清蛋白質(zhì)譜，對(duì)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期發(fā)現(xiàn)急性SCI后的重要差異表達(dá)蛋白。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2013年7月—2014年12月，收集9例急性頸部SCI患者（傷后24 h內(nèi)）作為病例組，收集9例性別、年齡與病例組相匹配的健康體檢者作為對(duì)照組。病例組均為男性，年齡32 ～ 55歲，平均47歲，記錄患者損傷時(shí)間，并進(jìn)行頸椎日本骨科學(xué)會(huì)（JOA）評(píng)分［4］。對(duì)照組也均為男性，年齡31 ～ 54歲，平均44歲。2組患者均無(wú)惡性腫瘤、自身免疫病及慢性傳染病等疾病。

1.2 儀器及主要試劑

酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀（CTL公司，美國(guó)）；Q-Exactive液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（Thermo公司，美國(guó)）；EASY-nLC1000納升級(jí)流速高效液相色譜系統(tǒng)（Thermo公司，美國(guó)）；去除人14種高豐度蛋白的多重親和排除系統(tǒng)（Aligent公司，美國(guó)）；胰蛋白酶（Promega公司，美國(guó)）。

1.3 血液樣本收集和血清蛋白處理

患者傷后送入急診時(shí)即用肝素抗凝采血管收集其空腹靜脈血液，4℃離心（1 500 r/min，離心半徑19.5 cm，10 min）。每3份血清樣本隨機(jī)合并，作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每組3個(gè)重復(fù)。取血清樣品，去除血清中高豐度蛋白，將低豐度蛋白超濾濃縮。濃縮后加入適量裂解液，沸水浴15 min，定量后，-80℃保存。每份樣品取200 μg，加入二硫蘇糖醇（DTT）至濃度為100 mmol/L，4℃離心（8 000 r/min，離心半徑19.5 cm，10 min），離心2次后加入0.5%胰蛋白酶40 μL，37℃孵育18 h。

1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

按定量結(jié)果取3 μg酶解產(chǎn)物進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，采用EASY-nLC1000納升級(jí)流速高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。經(jīng)液相分離后用Q-Exactive液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長(zhǎng)為120 min，檢測(cè)方式為正離子，母離子（m/z）掃描范圍為300 ～ 1 800。

1.5 非標(biāo)記分析和生物信息學(xué)分析

將液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜原始文件導(dǎo)入Maxquant 1.3.0.5軟件進(jìn)行非標(biāo)記定量分析，數(shù)據(jù)庫(kù)為ipi.human.3.68.fasta。所得的查庫(kù)文件使用Perseus 1.3.0.4軟件進(jìn)行分析。獲得的差異表達(dá)蛋白在基因本體論（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋分析，包括細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過(guò)程分析。在京都基因與基因組百科全書（KEGG）軟件進(jìn)行通路分析。采用Cytoscape 3.2.1軟件的BiNGO 3.0.3插件進(jìn)行富集分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間各血清蛋白質(zhì)平均豐度的差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)結(jié)果P ＜ 0.05或差異倍數(shù)＞ 2的蛋白被認(rèn)為是差異表達(dá)蛋白。采用Spearman相關(guān)分析探討差異表達(dá)蛋白與年齡、損傷時(shí)間以及JOA評(píng)分的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 基本信息

病例組9例患者損傷時(shí)間為3 ～ 24（16.4±3.1）h，頸椎JOA評(píng)分為6 ～ 13（9.2±1.7）分。

2.2 差異表達(dá)蛋白

共發(fā)現(xiàn)483個(gè)蛋白，其中22個(gè)蛋白呈現(xiàn)差異表達(dá)。與對(duì)照組相比，病例組中有11個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，包括果糖-二磷酸醛縮酶、碳酸酐酶等；11個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)，包括免疫球蛋白等（表1）。

2.3 差異表達(dá)蛋白與損傷時(shí)間及JOA評(píng)分的關(guān)系

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，11個(gè)表達(dá)上調(diào)蛋白與損傷時(shí)間和頸椎JOA評(píng)分呈正相關(guān)；11個(gè)表達(dá)下調(diào)蛋白與損傷時(shí)間和頸椎JOA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（表1）；22個(gè)差異表達(dá)蛋白均與損傷時(shí)年齡無(wú)關(guān)。

2.4 生物信息學(xué)分析

GO和BiNGO分析結(jié)果顯示，22種差異表達(dá)蛋白主要參與碳酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)、碳酸酐酶活性、B細(xì)胞受體信號(hào)通路及細(xì)胞活化過(guò)程（表2），主要富集于大分子復(fù)合物、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器及膜封閉腔（表3）。將所有的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG通路分析，共發(fā)現(xiàn)了4個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝通路：果糖和甘露糖代謝通路、血小板激活代謝通路、黏附連接代謝通路和氮代謝通路。

表1 差異表達(dá)蛋白與損傷時(shí)間、JOA評(píng)分的相關(guān)性Tab. 1 Correlation analysis between differentially proteins and time of injury，JOA score

表2 GO分子功能分類Tab. 2 GO molecular functional classification

表3 GO細(xì)胞成分分類（2級(jí)）Tab. 3 GO cellular component classification（Level 2）

3 討 論

本研究通過(guò)研究頸部急性SCI（24 h內(nèi)）患者與健康人群血液中蛋白質(zhì)組的差異，篩選出22個(gè)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，其中11個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，且與損傷程度（JOA評(píng)分）及損傷時(shí)間呈正相關(guān)；11個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)，且與損傷程度（JOA評(píng)分）及損傷時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。并且這些差異表達(dá)蛋白主要富集在果糖和甘露糖代謝通路、血小板激活代謝通路、黏附連接代謝通路及氮代謝通路。

關(guān)于SCI后繼發(fā)性損傷的機(jī)制目前有幾種假說(shuō)：脊髓微循環(huán)障礙機(jī)制、免疫炎性反應(yīng)機(jī)制、興奮性氨基酸毒性機(jī)制、氧自由基過(guò)氧化反應(yīng)損傷機(jī)制、鈣離子內(nèi)流機(jī)制等。有多種細(xì)胞因子參與上述機(jī)制過(guò)程，SCI可改變相關(guān)蛋白的表達(dá)，并將這些蛋白釋放到血液中［5］。

研究發(fā)現(xiàn)，SCI會(huì)刺激機(jī)體發(fā)生自身免疫反應(yīng)，參與反應(yīng)的細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞及吞噬細(xì)胞等。這些細(xì)胞在SCI后被激活，釋放炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子來(lái)攻擊靶細(xì)胞。SCI后的脫髓鞘反應(yīng)能激活T細(xì)胞，使T細(xì)胞表面產(chǎn)生大量的細(xì)胞黏附分子，從而易于進(jìn)入血腦屏障來(lái)抑制軸突壞死［6］。而B細(xì)胞在SCI后的增殖和活化受到抑制，具體表現(xiàn)為外周血B細(xì)胞數(shù)量減少，非胸腺依賴性B細(xì)胞活化受到抑制［7］。本研究也發(fā)現(xiàn)黏附連接代謝通路激活，而B細(xì)胞受體信號(hào)通路受到抑制，與上述研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)果糖和甘露糖代謝相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，果糖和甘露糖代謝途徑異常激活，說(shuō)明SCI時(shí)中心代謝明顯增強(qiáng)，這與既往報(bào)道一致［8-10］。SCI可以引起嚴(yán)重的病理生理反應(yīng)，包括炎性反應(yīng)、代謝失調(diào)和線粒體損傷，而能量損失與神經(jīng)損傷相關(guān)。推測(cè)該代謝通路的激活可以歸結(jié)于SCI后細(xì)胞缺乏能量所致。Carpenter等［11］發(fā)現(xiàn)，在果糖和甘露糖代謝通路中，神經(jīng)元可以利用乳酸作為底物產(chǎn)能。Yan等［12］根據(jù)GO分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCI后大部分差異表達(dá)蛋白為能量代謝酶。Chen等［13］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)急性SCI后糖酵解途徑中的果糖-二磷酸醛縮酶會(huì)明顯升高，且這種酶對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用。此外，碳酸酐酶家族在急性SCI后表達(dá)異常升高，考慮和脈管系統(tǒng)的破壞密切相關(guān)［3］。

SCI早期會(huì)出現(xiàn)脊髓灰質(zhì)周圍的出血、低灌注、微血栓形成，白質(zhì)部位髓鞘腫脹。損傷刺激會(huì)導(dǎo)致血小板活化因子釋放增多，在SCI的炎性反應(yīng)和繼發(fā)性損傷中發(fā)揮毒性作用［14］。肖建如等［15］按損傷程度對(duì)SCI患者進(jìn)行分組及動(dòng)態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)各組患者的全血血小板活化因子均有不同程度升高，持續(xù)至傷后7 d，全血血小板活化因子含量增高和損傷程度呈正相關(guān)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組相比，SCI患者的血小板激活代謝通路表達(dá)活躍。

急性SCI還會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體的免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量一氧化氮合酶，而一氧化氮被認(rèn)為在繼發(fā)性SCI發(fā)生機(jī)制中起著重要作用。SCI發(fā)生后一氧化氮的合成逐漸增加，至傷后12 h達(dá)到高峰［16］。本研究亦發(fā)現(xiàn)急性SCI后氮代謝通路異?；钴S，側(cè)面印證了上述報(bào)道。

本研究并沒有發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激蛋白或軸突生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的表達(dá)異常，這可能和本研究選取的時(shí)間點(diǎn)較早（損傷后24 h之內(nèi)）有關(guān)。據(jù)報(bào)道，急性SCI中重要的氧化應(yīng)激蛋白之一谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶一般在傷后24 h出現(xiàn)，而與軸突生長(zhǎng)相關(guān)的蛋白出現(xiàn)得更晚一些［3，17］。

綜上，本研究通過(guò)對(duì)急性SCI患者及健康人群的血清蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)急性SCI后果糖和甘露糖代謝通路、血小板激活代謝通路、黏附連接代謝通路及氮代謝通路活躍，B細(xì)胞受體信號(hào)代謝通路則受到抑制。果糖-二磷酸醛縮酶、碳酸酐酶等有望成為急性SCI潛在的分子標(biāo)志物，為后續(xù)評(píng)估急性SCI病情進(jìn)展及病理機(jī)制提供了一定依據(jù)。