齒瓣石豆蘭化學(xué)成分的分離及其抗腫瘤活性研究

陳小兵，黃麗蕓，許 軍，凌志杰，潘建萍，彭 紅

(1.贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江西 贛州 341000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004)

石豆蘭屬(Bulbophyllum)是蘭科(Orchidaceae)樹蘭族(Trib.Epidendreae)石豆蘭亞族(Subtrrib.Bulbophyllinae)下屬之一，大多生長(zhǎng)在石灰?guī)r上。其性味甘辛，具有養(yǎng)胃生津、祛風(fēng)除濕、消腫止痛、清熱化痰、舒筋骨、涼血活血的功效[1-2]，可用于治療高熱驚風(fēng)、風(fēng)濕痹痛、四肢麻木、癰腫、咽痛[3]。藥用石豆蘭屬有15種，主要分布于江西、廣西、湖北、廣東、江蘇、安徽和云南，其中云南省分布最多，有12種之多。江西齒瓣石豆蘭(Bulbophyllum.levineiSchltr)主要分布于遂川、井岡山、廬山等山區(qū)。本研究對(duì)贛南地區(qū)產(chǎn)的齒瓣石豆蘭藥材進(jìn)行了分離純化，共得到9個(gè)化合物，經(jīng)波譜分析鑒定為化合物1：7-羥基-3-(4’-羥苯基)異黃酮；化合物2：槲皮素；化合物3：2-甲氧基-1-羥基苯甲醛；化合物4：6-甲氧基-7羥基-異黃酮；化合物5：鄰羥基苯甲酸；化合物6：6-甲氧基-2-(4’-甲氧基苯基)-3-羥黃酮；化合物7：棕櫚酸乙酯；化合物8：3-甲氧基-4’-羥黃酮；化合物9：4’-甲氧基-2-甲基-7-羥異黃酮。

本研究豐富了齒瓣石豆蘭的黃酮類化學(xué)成分及其抗腫瘤活性的有效成分，為進(jìn)一步研究齒瓣石豆蘭的抗腫瘤活性及有效成分提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀；Inova 500型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；Agilent 1100 Series LC/MSD 質(zhì)譜儀；制備液相色譜儀為 Shimadzu LC-6AD (制備柱，YMC-Pack ODS-A)；大孔吸附樹脂HP-20(日本三菱公司)；LH-20型葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20Amersham Pharmacia Biotech 公司)；反相硅膠柱(日本YMC公司)；ACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 藥材

齒瓣石豆蘭全草于2018年6月采自江西贛州，標(biāo)本的性狀特征依照有關(guān)文獻(xiàn)[4]的描述，并由江西古漢精制中藥飲片有限公司總經(jīng)理顏干明(國(guó)家二級(jí)技師)鑒定為齒瓣石豆蘭(Bulbophyllum.levineiSchltr)。憑證樣品保存于贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院中藥標(biāo)本室。

人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株、人慢性白血病K562細(xì)胞株和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株(美國(guó)ATCC公司)。

1.3 其他試驗(yàn)用品

硅膠GF254；柱色譜硅膠G(青島海洋化工有限公司，200～300目)；LH-20型葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱色譜(Amersham Pharmacia Biotech)。實(shí)驗(yàn)中所涉及的化學(xué)試劑均為色譜純或分析純級(jí)別。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

取齒瓣石豆蘭全草10 kg，將其粉碎后過40目篩，用10倍量70%乙醇依照浸漬的方法依次提取3次(每次浸4 h)，然后合并3次乙醇提取液，減壓蒸發(fā)濃縮后得到濃縮提取物2.6 kg。取提取物1.0 kg，再將10倍的95%乙醇加熱回流提取3次(每次4 h)。乙醇提取液減壓蒸發(fā)濃縮后，得到的棕色浸膏用水再次分散攪拌，用氯仿、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取液減壓濃縮回收溶劑后得浸膏，得到浸膏460 g棕色物，水溶解后用Diaion HP-20型大孔吸附樹脂吸附，分別用水、15%乙醇溶液、45%乙醇溶液及75%乙醇溶液洗脫進(jìn)行層析分離經(jīng)TLC檢測(cè)合并相同流分，得到4個(gè)部分(Fr.1～4)。Fr.1(5.8 g)經(jīng)反相硅膠色譜柱，氯仿-甲醇(20∶1～5∶1)系統(tǒng)梯度洗脫，目標(biāo)成分再經(jīng)結(jié)晶得到化合物1(21 mg)、化合物2(9 mg)。Fr.2(6.4 g)再經(jīng)反相硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(20∶1～10∶1)混合溶劑梯度洗脫得到化合物3(11 mg)、化合物4(6 mg)和化合物5(15 mg)。Fr.3(7.6 g)經(jīng)LH-20型葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(5∶1～1∶10)混合溶劑甲醇洗脫，反復(fù)重結(jié)晶后得到化合物6(13 mg)和化合物7(9 mg)。Fr.4(4.5 g)經(jīng)反相硅膠柱色譜，氯仿-丙酮(20∶1～5∶1)系統(tǒng)梯度洗脫，收集到了化合物8(16 mg)、化合物9(5 mg)。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

確認(rèn)化合物結(jié)構(gòu)主要是根據(jù)化合物特有的物理和化學(xué)性質(zhì)以及化合物的波譜數(shù)據(jù)?；衔锏奈锢砗突瘜W(xué)性質(zhì)包含化合物的形狀、熔點(diǎn)及化學(xué)特征反應(yīng)等。化合物的波譜數(shù)據(jù)主要包括紅外光譜(IR)數(shù)據(jù)、紫外光譜(UV)數(shù)據(jù)、核磁共振碳譜和氫譜(13C-NMR和1H-NMR)數(shù)據(jù)、電子轟擊離子源-質(zhì)譜聯(lián)用(EI-MS)數(shù)據(jù)。從齒瓣石豆蘭中乙醇提取物分離得到的化合物依據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果，鑒定其結(jié)構(gòu)如下。

化合物1：淡黃色針狀結(jié)晶，分子式為C15H10O4，mp：317～318 ℃?；衔锿ㄟ^鹽酸-鎂粉的試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果為陽性，提示此化合物為黃酮類成分。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗(yàn)結(jié)果顯示藍(lán)黑色，提示此化合物含有酚羥基。紅外光譜(IR)(KBr)提示：羥基的最大吸收在3 265 cm-1處，C=O的吸收峰：1 709 cm-1處。1 627、1 586、1 511、1 456、1 289、1 249、1 209、856 cm-1幾處峰提示為此結(jié)構(gòu)為苯環(huán)。UV(乙醇)nm：219，295。EI-MS：m/z 254.7[M]+。1H-NMR(CD3OD，400 MHz)δ：6.75(d，2H，J=8.2 Hz，H-6，8)，6.89(d，2H，J=2.0 Hz，H-3’，-5’)，7.41(d，2H，H-2’，-6’)，7.9(d，1H，H-5)，8.21(s，1H，H-1)，9.7(s，1H，OH)，10.81(s，1H，OH)。13C-NMR(CD3OD，100 MHz)δ：102.1(C-3’，5’)，116.1(C-6，8)，122.4(C-4)，123.5(C-2)，125.7(C-1’)，128.2(C-2’，6’)，131.1(C-5)，153.2(C-1)，156.9(C-7，4’)，175.3(C-3，C=O)。以上化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)以及光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道基本一致，故鑒定為7-羥基-3-(4’-羥苯基)異黃酮。

化合物2：淡黃色針狀，分子式為C15H10O7，mp：311～313 ℃。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗(yàn)結(jié)果顯示藍(lán)黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示在3 442cm-1處有羥基的最大吸收峰。C=O的吸收峰在1 612 cm-1和1 660 cm-1處。苯環(huán)吸收：1 625、1 581、1 511、1 428、1 145、1 119、1 011、821cm-1。EI-MS：m/z 302[M]+。1H-NMR(CD3OD，400MHz)δ：6.01(d，1H，J=2.3Hz，H-6)，6.21(d，1H，J=2.4Hz，H-8)，6.61(d，1H，J=8 Hz，H-5’)，6.75(d，1H，J=8.5 Hz，H-6’)，6.61(d，1H，J=8 Hz，H-5’)，7.13(d，1H，J=8，2.5 Hz，H--2’)，9.23(s，1H，3’-OH)，9.33(s，1H，4’-OH)，9.23(d，1H，4’-OH)，10.21(s，1H，7-OH)，12.23(s，1H，5-OH)，13.02(s，1H，3-OH).13C-NMR(CD3OD，100MHz)δ：95.5(C-8)，98.3(C-6)，104.9(C-4)，112.8(C-6’)，118.1(C-3’)，120.8(C-2’)，125.8(C-1’)，138.2(C-2)，146.9(C-4’)，147.9(C-5’)，160.5(C-1)，164.2(C-5)，166.2(C-7)，179.1(C-3，C=O)。以上化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)以及光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道基本一致，故鑒定為槲皮素。

化合物3：白色粉末狀，分子式為C8H8O3，mp：81～82 ℃。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗(yàn)結(jié)果顯示藍(lán)黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示：在3 268 cm-1有羥基的吸收峰。1 627、1 589、1 514、1 458 cm-1顯示為苯環(huán)。1H-NMR(DMSO，300 MHz)譜芳香區(qū)中δ7.11(1H，d，J=1.9 Hz)，7.32(1H，d，J=8.0 Hz)和7.38(1H，d，J=2.0Hz)為一典型的1，2，4三取代苯環(huán)的特征吸收。13C-NMR(DMSO，400MHz)中所顯示的δ55.4說明該分子中有-OCH3的存在。1H-NMR(DMSO，300 MHz)δ:9.79(1H，s，CHO)，7.41(1H，d，J=2.0 Hz)，7.34(1H，d，J=2.3 Hz)，7.01(1H，d，J=2.3 Hz)，3.87(3H，s，-OCH3)，4.95(1H，s，OH)。13C-NMR(DMSO，400 MHz)δ：189.9(-CHO)，148.5(C-4)，153.4(C-3)，128.7(C-1)，126.4(C-6)，116.5(C-5)，113.7(C-2)，55.8(-OCH3)。以上化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)以及光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致，故鑒定為2-甲氧基-1-羥基苯甲醛，又名香蘭素。

化合物4：淡黃色油狀，分子式為C16H12O4，mp：291～293 ℃?；衔锿ㄟ^鹽酸-鎂粉的試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果為陽性，提示此化合物為黃酮類成分。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗(yàn)結(jié)果顯示藍(lán)黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示，在3 601cm-1處有羥基的最大吸收峰。C=O的吸收峰在1 615 cm-1和1 685 cm-1處。苯環(huán)吸收：1 597、1 601、1 572、1 467、1 136、1 120、1 108、838 cm-1。MS(ESI)m/z=268.01[M]+。1H-NMR(DMSO，300MHz)δ：3.81(s，3H，-OCH3)，6.21(s，1H，H-8)，7.11(s，1H，H-5)，7.15(dd，1H，J=2.2Hz，H-4’)，7.22(d，2H，J=8.0Hz，H-3’，5’)，7.43(d，2H，J=8.0Hz，H-2’，6’)，8.03(s，1H)，8.36(s，1H，7-OH)。13C-NMR(DMSO，400 MHz)δ：56.3(6-OCH3)，107.2(C-8)，117.3(C-5)，118.6(C-10)，122.8(C-3)，126.9(C-2’，6’)，128.4(C-4’)，130.8(C-3’，5’)，123.2(C-3)，131.9(C-1’)，152.1(C-9)，157.5(C-7)，158.2(C-2)，180.8(C-4，C=O)。以上化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)以及光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，故鑒定為6-甲氧基-7羥基-異黃酮。

化合物5：無色針狀粉末，分子式為C7H6O3，mp：158～159 ℃。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗(yàn)結(jié)果顯示藍(lán)黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示在3 642cm-1處有羥基的最大吸收峰。1H-NMR(CD3OD，400MHz)δ11.19(s，1H，-COOH)顯示有活潑氫。1H-NMR(CD3OD，400 MHz)譜芳香區(qū)中信號(hào)中在低場(chǎng)區(qū)有4組芳香氫質(zhì)子信號(hào)：δ7.79(dd，1H，J=8.0Hz，H-6)，7.51(d，1H，J=7.9，7.5Hz，H-4)，7.01(d，1H，J=8.0Hz，H-3)，6.89(d，1H，J=7.9，7.2Hz，H-5)提示分子中存在苯環(huán)的1,2-二取代。EI-MS：m/z 137.1[M]+。13C-NMR(CD3OD，100MHz)δ：113.5(C-1)，118.2(C-3)，132.1(C-6)，135.9(C-4)，162.5(C-2)，173.1(-COOH)。以上化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)以及光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定為鄰羥基苯甲酸，又名水楊酸。

化合物6：淡黃色針狀，分子式為C17H14O5，mp：138～139 ℃?；衔锿ㄟ^鹽酸-鎂粉的試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果為陽性，提示此化合物為黃酮類成分。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗(yàn)結(jié)果顯示藍(lán)黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示在3 510cm-1處有羥基的最大吸收，在1 728 cm-1有羰基吸收峰。苯環(huán)吸收：1 637、1 598、1 511、1 453 cm-1。EI-MS：m/z 299.1[M+H]+。1H-NMR(CD3OD，400MHz)δ：3.75(s，3H，-OCH3)，3.8(s，3H，-OCH3)，6.76(d，2H，H-3’，-5’)，6.81(d，1H，H-8)，6.84(d，1H，H-7)，7.22(d，2H，H-2’，-6’)，7.25(s，1H，H-5)，14.1(s，1H，-OH)。在較高場(chǎng)中出現(xiàn)的強(qiáng)單峰結(jié)合化學(xué)位移和碳譜13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)中所顯示的δ55.8兩峰，說明該分子中有兩個(gè)-OCH3，其質(zhì)子信為δ3.80(s，6H)。13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)δ：55.8(2-OCH3)，116.3(C-3’，5’)，117.3(C-5)，118.9(C-8)，128.4(C-2’，6’)，121.7(C-7)，125.6(C-4)，137.3(C-2)，150.1(C-9)，155.4(C-6)，159.4(C-4’)，161.1(C-1)，179.5(C-3，C=O)。以上化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)以及光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道基本一致，故鑒定為6-甲氧基-2-(4’-甲氧基苯基)-3-羥黃酮。

化合物7：白色蠟狀固體，分子式為C18H36O2，mp：23～24 ℃，薄層色譜法顯示：在碘蒸氣下有一單紅色斑點(diǎn)，固體化合物可溶于石油醚、乙酸乙酯中。MS(ESI)m/z=284[M]+。1H-NMR(DMSO，300MHz)δ：1.04(3H，t，J=8.0 Hz，-CH3)，1.28(3H，t，J=8.0 Hz，-CH3)，1.31(24H，t，J=7.8 Hz，-CH2)，2.34(2H，t，J=8.3 Hz，-CH2COO)，4.28(2H，t，J=8.0 Hz，-COOCH2)。13C-NMR(DMSO，400 MHz)δ：179.5(C=O)，64.31(C-2’，CH2)，34.21(C-2，CH2)，26.54～30.04，26.54，29.15，29.87(C-3-15，CH2)，15.21(C-16，-CH3)。以上化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)以及光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定為棕櫚酸乙酯。

化合物8：淡黃色針狀，分子式為C16H12O4，mp：280～282 ℃?；衔锿ㄟ^鹽酸-鎂粉的試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果為陽性，提示此化合物為黃酮類成分。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗(yàn)結(jié)果顯示藍(lán)黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示，在3 615 cm-1處有羥基最大吸收。C=O的吸收峰在1 619 cm-1和1 688 cm-1處。苯環(huán)吸收：1 592、1 602、1 578、1 460、1 123、1 118、1 103、821 cm-1(苯環(huán)C=C伸縮振動(dòng))；MS(ESI)m/z=268.03[M]+。1H-NMR(DMSO，300 MHz)譜中芳香區(qū)有4個(gè)氫信號(hào)顯示為δ：6.75(d，2H，J=2.0 Hz，H-3’，5’)、7.21(d，2H，J=2.0 Hz，H-2’，6’)，是典型的AA’BB’系統(tǒng)，說明該結(jié)構(gòu)為對(duì)位取代的苯環(huán)，對(duì)應(yīng)的碳信號(hào)在13C-NMR(DMSO，400MHz)譜中顯示為δ：115.6(C-3’，5’)、127.7(C-2’，6’)。1H-NMR(DMSO，300 MHz)δ：3.86(s，3H，-OCH3)，6.75(d，2H，J=2.0Hz，H-3’，5’)，6.90(d，1H，J=8.0Hz，H-8)，7.13(dd，1H，J=2.3 Hz，H-6)，7.21(d，2H，J=2.0 Hz，H-2’，6’)，7.43(d，1H，J=8.0 Hz，H-7)，7.79(d，1H，J=8.0 Hz，H-5)，8.56(s，1H，4’-OH)。13C-NMR(DMSO，400 MHz)δ：58.3(3-OCH3)，115.6(C-3’，5’)，119.5(C-8)，122.8(C-6)，123.8(C-1’)，125.1(C-10)，127.7(C-2’，6’)，131.4(C-5)，140.2(C-7)，141.9(C-3)，156.7(C-2)，157.5(C-9)，158.4(C-4’)，179.2(C-4，C=O)。以上化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)以及光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定為3-甲氧基-4’-羥黃酮。

化合物9：黃色針狀結(jié)晶，分子式為C17H14O4，mp：228～230 ℃?；衔锿ㄟ^鹽酸-鎂粉的試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果為陽性，提示此化合物為黃酮類成分。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗(yàn)結(jié)果顯示藍(lán)黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示在3 158 cm-1處有羥基的最大吸收峰，1 725 cm-1有羰基吸收峰。在較高場(chǎng)中出現(xiàn)了強(qiáng)單峰，通過化學(xué)位移和碳譜13C-NMR(DMSO，400MHz)數(shù)據(jù)顯示的δ58.6說明該結(jié)構(gòu)中存在-OCH3，其質(zhì)子的信號(hào)為：3.80(s，3H，-OCH3)。苯環(huán)吸收：1 701、1 619、1 543、1 427、1 301、1 257、1 229、849 cm-1。UV(乙醇)nm：219，295。MS(ESI)m/z：283.07[M+1]。1H-NMR(DMSO，300 MHz)譜中芳香區(qū)有4個(gè)氫信號(hào)顯示為δ：6.81(d，2H，J=2.2 Hz，H-3’，-5’)、7.25(d，2H，J=8.2 Hz，H-2’，-6’)，是典型的AA’BB’系統(tǒng)，說明該結(jié)構(gòu)為對(duì)位取代的苯環(huán)，其對(duì)應(yīng)的碳信號(hào)于13C-NMR(DMSO，400MHz)譜中顯示為δ：128.3(C-2’，6’)、115.7(C-3’，5’)。1H-NMR(DMSO，300MHz)δ：2.31(s，3H，H-2)，3.80(s，3H，H-4’)，6.05(s，1H，OH)，6.85(s，1H，H-8)，6.81(d，2H，J=2.2 Hz，H-3’，-5’)，6.97(d，1H，J=8.0 Hz，H-6)，7.25(d，2H，J=8.2 Hz，H-2’，-6’)，7.81(d，1H，J=7.8 Hz，H-5)。13C-NMR(DMSO，400 MHz)δ：20.1(C-CH3)，58.6(4’-OCH3)，107.2(C-8)，110.1(C-6)，113.5(C-3)，115.7(C-3’，5’)，118.2(C-10)，125.1(C-1’)，128.3(C-2’，6’)，131.9(C-5)，155.3(C-2)，158.2(C-9)，159.8(C-4’)，168.3(C-7)，179.5(C-4，C=O)。以上化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)以及光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定為4’-甲氧基-2-甲基-7-羥異黃酮。

2.3 齒瓣石豆蘭乙醇提物對(duì)人慢性白血病K562細(xì)胞、人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株的抑瘤活性的影響

由表1可見，齒瓣石豆蘭醇提物給藥后小鼠體重正常，與陰性對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.75，0.36，0.39，均>0.05)，給DDP(1 mg·kg-1)后小鼠體重明顯減輕，為(17.73±1.63)g，與陰性對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各實(shí)驗(yàn)組分別給予齒瓣石豆蘭醇提物10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1三種濃度后，瘤重分別為(1.55±0.680)、(1.97±0.34)、(0.17±0.38)g，與陰性對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018，0.002，0.001，均<0.01)。K562、HT-29、MCF-7三種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，且呈現(xiàn)出較好的劑量依賴性。

組別體重給藥前給藥后瘤重抑制率(%)K562HT-29MCF-7 陰性對(duì)照組20.16±2.3525.63±3.741.84±0.93/// 陽性對(duì)照組22.03±2.2117.73±1.63??0.64±0.2167.9568.6564.39乙醇提取物10mg·kg-121.67±2.2427.84±3.131.55±0.68?23.3426.9121.05 20mg·kg-121.75±2.3729.17±4.841.97±0.34??45.8247.2540.92 40mg·kg-121.69±2.3829.65±4.160.17±0.38??50.9752.4549.42??

注：與陰性對(duì)照組比較，**P<0.01；與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4 抗腫瘤活性研究

采用MTT法[16]，以化合物1～9(4個(gè)不同濃度)為供試藥物對(duì)K562、MCF-7進(jìn)行體外抗腫瘤試驗(yàn)，結(jié)果見表2。表2顯示：化合物7抗腫瘤活性較弱，化合物2、3、5幾乎沒有抑制K562、MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，對(duì)K562、MCF-7的抑制率較低?；衔?、7在低濃度下甚至可刺激兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)?；衔?、4、6、8、9能明顯抑制K562、MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)，抗腫瘤活性較好，且同一化合物在相同濃度下對(duì)MCF-7抑制作用更好，可能是由于黃酮類化合物可明顯抑制K562、MCF-7生長(zhǎng)，作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

表2 化合物1-9對(duì)K562、MCF-7細(xì)胞的抑制作用

3 討論

齒瓣石豆蘭全草具有較高的藥用價(jià)值，具有養(yǎng)胃生津、祛風(fēng)除濕、消腫止痛、清熱化痰、舒筋骨、涼血活血的功效。本研究對(duì)齒瓣石豆蘭的乙醇提取部分進(jìn)行了分離及鑒定，將乙醇提取物經(jīng)硅膠柱層析、薄層層析、LH-20型葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱色譜分離和重結(jié)晶等方法進(jìn)行分離純化后得到9個(gè)單體化合物，并根據(jù)化合物的特有物理和化學(xué)性質(zhì)以及化合物的波譜數(shù)據(jù)，鑒定其結(jié)構(gòu)分別為化合物1：7-羥基-3-(4’-羥苯基)異黃酮；化合物2：槲皮素；化合物3：2-甲氧基-1-羥基苯甲醛；化合物4：6-甲氧基-7羥基-異黃酮；化合物5：鄰羥基苯甲酸；化合物6：6-甲氧基-2-(4’-甲氧基苯基)-3-羥黃酮；化合物7：棕櫚酸乙酯；化合物8：3-甲氧基-4’-羥黃酮；化合物9：4’-甲氧基-2-甲基-7-羥異黃酮。所有化合物均為首次從齒瓣石豆蘭全草中分離得到。其中化合物1、8、9為首次報(bào)道。采用MTT方法篩選具有明顯抗腫瘤活性的化合物，結(jié)果顯示化合物1、4、6、8、9具有較好的抗腫瘤活性，對(duì)K562、HT-29、MCF-7三種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)出較好的劑量依賴性。

本研究結(jié)果豐富了傳統(tǒng)中藥齒瓣石豆蘭的活性成分以及抗腫瘤活性研究，并對(duì)黃酮類化合物抗腫瘤的作用機(jī)制研究具有一定的參考價(jià)值，為今后齒瓣石豆蘭化學(xué)成分的藥理活性研究提供了理論依據(jù)。