CD133、CD34、DOG-1在胃腸間質(zhì)瘤中的表達及其意義

陳雙江 舒俊偉 杜嘉原 汪富濤 成 勇 徐 冰 李 娜 樊 林

胃腸間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)源于消化道的間葉組織，可以發(fā)生在消化道的任何部位，其中胃是間質(zhì)瘤發(fā)病率最高的場所。胃腸間質(zhì)瘤是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤[1]，約占胃腸道腫瘤發(fā)病率的2%左右，GIST的發(fā)病率為1～2/10萬，且主要發(fā)生在中老年，40歲以下患GIST風險較低，而且發(fā)病率在性別方面無差異。早期GIST的診斷方法主要是針對免疫組織化學(xué)標志物的檢測，近年來，也出現(xiàn)一些免疫組織化學(xué)標志物的聯(lián)合檢測，但是CD133、CD34、DOG-1的聯(lián)合檢測意義尚沒有相關(guān)報道。另外，KIT 陽性的胃腸道間質(zhì)瘤通常表現(xiàn)為梭型細胞形態(tài)，而 KIT 陰性的胃腸道間質(zhì)瘤有 PDGFRA 突變可以是上皮樣或混合型[2-3]。目前為止，間質(zhì)瘤的確切發(fā)病機制尚不清楚，并且沒有明確的生物標志物預(yù)測其預(yù)后。本研究通過研究胃腸間質(zhì)瘤組織中CD133、CD34、DOG-1的含量，探討這3種指標對胃腸間質(zhì)瘤臨床治療的意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

我院自2015年1月至2017年6月間收治的150例胃腸間質(zhì)瘤患者作為研究對象，其中男性83例，女性67例。腫瘤發(fā)生部位：直腸7例，胃68例，十二指腸13例，空回腸42例，結(jié)腸8例，胃腸道外12例。

1.2 納入和排除標準

1.2.1 納入標準 ①經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為胃腸間質(zhì)瘤；②采樣前未經(jīng)過其他治療；③年齡在18歲以上；④患者無其他重大疾病史。

1.2.2 排除標準 ①有嚴重基礎(chǔ)性疾??；②1個月內(nèi)有大手術(shù)或大出血；③年齡大于75歲。

1.3 試劑與方法

1.3.1 試劑 本研究中采用的抗體CD133(兔抗人多克隆抗體1∶100)，抗體CD34(單克隆抗體1∶50)，抗體DOG-1(兔抗人多克隆抗體1∶100)，均購自sigma公司。

1.3.2 免疫組化的方法[4]將載玻片放入烤箱中，60 ℃ 1 h，室溫冷卻載玻片；二甲苯浸洗3次，每次10 min；梯度乙醇水化，100%→85%→75%。，每次3 min；蒸餾水浸洗3次，每次3 min；將玻片浸入盛有500 ml 0.01 M檸檬酸鹽溶液的燒杯中，保鮮膜覆蓋，微波高火加熱至沸騰，調(diào)整至解凍溫度，12 min；室溫冷卻，蒸餾水浸洗3次。每次3 min；3%H2O2浸洗10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶；蒸餾水浸洗一次，3 min，PBS浸洗2次，每次3 min；100 μl 10%羊血清室溫封閉10 min；取100 μl 各種抗體加在組織上，4 ℃過夜；將玻片從冰箱中取出，復(fù)溫至室溫；PBS浸洗3次，每次3 min；取100 μl二抗加在組織上，37 ℃孵育，30 min；取100 μl稀釋好的DAB顯色；蘇木精復(fù)染，溫水核反藍，生物膠封片。使用高倍顯微鏡觀察，對視野中的組織切片染色情況進行定性判斷。判斷指標：免疫組化染色陽性細胞數(shù)>10%即認為該病例陽性，記為“1”，陽性細胞數(shù)<10%記為陰性，記為“2”[5]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，檢測方式選卡方檢驗。3種胃腸間質(zhì)瘤標志物相關(guān)性分析采用Speraman等級分析，并以P<0.05表示為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果

在本研究中的150例胃腸間質(zhì)瘤患者病理標本免疫組化切片結(jié)果為，CD133陽性率為42.0%(63/150)，CD34陽性率為38.7%(58/150)，而DOG-1陽性率為84.7%(127/150)。所有的病理切片的標本都進行了HE染色，CD133陽性表達于細胞膜或者細胞質(zhì)中，CD34陽性表達于細胞質(zhì)中，DOG-1陽性表達于細胞質(zhì)中。

2.2 蛋白CD133、CD34、DOG-1表達與胃腸間質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系

研究結(jié)果表明，蛋白CD133陽性率在年齡因素中構(gòu)成比差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，蛋白CD34陽性率在腫瘤大小和風險分級中構(gòu)比差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，蛋白DOG-1陽性率在腫瘤部位和性別以及腫瘤浸潤程度中構(gòu)比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)(表1)。

2.3 蛋白CD133、CD34、DOG-1在胃腸間質(zhì)瘤組織中表達的相關(guān)性分析

將蛋白CD133、CD34、DOG-1進行相關(guān)性分析，顯示，DOG-1與CD133以及CD34的表達均成正相關(guān)(P<0.05)；而CD133與CD34之間沒有顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

3 討論

胃腸間質(zhì)瘤(GIST)是起源于胃腸道間葉組織的腫瘤，具體發(fā)生于胃腸道肌壁間，并且具有分化潛能的非上皮性、非血管性脂肪組織和淋巴造血組織的一類腫瘤，可以發(fā)于胃腸道、腹膜后、腸系膜、肝臟等部位，其中主要發(fā)生部位是小腸、胃。80%以上的胃腸道間質(zhì)瘤的基因突變類型是KIT或者PDGFRA的突變，KIT突變的胃腸道間質(zhì)瘤通常表現(xiàn)為梭型細胞形態(tài)，而PDGFRA的突變可以是上皮樣或混合型[6-7]，這些基因的突變伴隨著胃腸間質(zhì)瘤的產(chǎn)生與發(fā)展，并且可能會導(dǎo)致多種分子事件的發(fā)生。胃腸間質(zhì)瘤患者通常沒有顯著性的臨床表現(xiàn)特異性，這加大了臨床上的診斷難度，以前主要是通過免疫組織化學(xué)標志物的含量檢測來判斷，而且經(jīng)常用到的指標是CD117、CD34和DOG-1，而CD133在胃腸間質(zhì)瘤中表達情況的報道很少見。

CD133是1種質(zhì)膜糖蛋白，分子量為120 KD，由865個氨基酸構(gòu)成的跨膜蛋白，基因定位于4p15.32，主要在細胞膜以及細胞質(zhì)中表達，是人類造血干細胞的生物標志物[8]，據(jù)文獻記載，CD133蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，很有可能是腫瘤特異的生物標志物，并且在肝癌、肺癌、胃癌等癌癥干細胞中表達[9]。此外CD133蛋白可以提高腫瘤細胞的侵襲能力并且能夠增強其生殖能力，從而直接導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后效果不佳及生存率低[10]，同時側(cè)面反映CD133可能是判斷腫瘤患者預(yù)后情況的潛在指標。CD34分子屬于鈣黏蛋白家族，選擇性表達于人類的造血干細胞中，并且會隨著細胞的逐漸成熟而表達量逐漸減低直至消失。CD34分子在60%左右的胃腸間質(zhì)瘤中陽性表達，是胃腸間質(zhì)瘤檢測的1個重要生物指標[11]。而DOG-1是近幾年研究發(fā)現(xiàn)的胃腸間質(zhì)瘤的新的特異性標志物，由DOG-1編碼，由8個跨膜區(qū)域組成的、鈣調(diào)節(jié)氯通道蛋白。據(jù)外文文獻報道，在胃腸間質(zhì)瘤的診斷中，DOG-1的特異性及敏感性均達到100%[12]。3個指標之間的相互關(guān)聯(lián)研究尚少，本研究對上面所述的3個指標蛋白在胃腸間質(zhì)瘤中表達情況以及這3個指標表達之間相關(guān)性進行了分析探討，結(jié)果表明，這3種蛋白都在胃腸間質(zhì)瘤中呈高表達，而且蛋白CD133陽性率在年齡因素中構(gòu)成比差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，蛋白CD34陽性率在腫瘤大小和風險分級中構(gòu)比差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，蛋白DOG-1陽性率在腫瘤部位和性別以及腫瘤浸潤程度中構(gòu)比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，提示胃腸間質(zhì)瘤與患者的年齡、性別、腫瘤的直徑、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤浸潤程度以及風險分級等臨床病理參數(shù)有關(guān)，該結(jié)果也表明隨著病情越嚴重，腫瘤細胞異性也隨之變得很明顯，伴隨DOG-1的表達量增加，此種免疫組織化學(xué)標志物在體內(nèi)的含量變化提示它對胃腸間質(zhì)瘤的發(fā)展和預(yù)后在臨床方面具有一定的價值；另外，該研究進一步分析發(fā)現(xiàn)DOG-1與CD133和CD34均呈正相關(guān)，提示DOG-1可能與CD133和CD34之間協(xié)同促進胃腸間質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展[13-15]。

表1 CD133、CD34、DOG-1陽性表達與GIST臨床特征的關(guān)系/例

表2 CD133、CD34、DOG-1在胃腸間質(zhì)瘤患者組織表達相關(guān)性分析

綜上所述，CD133、CD34、DOG-1均高表達于胃腸間質(zhì)瘤患者組織中，其中DOG-1的陽性表達率最高，并且三者可能存在協(xié)同刺激作用，共同促進了胃腸間質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。