海蘭褐雞腸道菌群多樣性分析

王?；?， 張曉峰 ， 祁畫麗 ， 包文奇

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)學院 鄭州市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室 , 河南 鄭州 450046)

腸道菌群被譽為機體自身的“黑匣子”,是腸道重要的的組成部分,與宿主自身營養(yǎng)物質(zhì)的消化、代謝以及免疫功能等方面密切相連[1-2]。腸道菌群與宿主之間的這種動態(tài)平衡，對動物機體生命活動的正常運轉(zhuǎn)具有十分重要的意義。一旦這種平衡被打破(如疾病等)，條件性的腸道致病菌便會趁虛而入，動物就有可能產(chǎn)生一系列胃腸道疾病。研究表明，不只是胃腸道疾病，許多疾病都與腸道微生態(tài)失調(diào)有關(guān)系[3-4]。隨著養(yǎng)禽行業(yè)迅速發(fā)展，腸道菌群失調(diào)導致家禽疾病越來越嚴重，因此，關(guān)注家禽腸道健康，研究其腸道菌群結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律有助于調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[5]。本試驗采用不同培養(yǎng)基對海蘭褐雞腸道菌群進行分離培養(yǎng)和16S rDNA測序，并進行分類學和系統(tǒng)發(fā)育研究，將為開發(fā)更有針對性的微生態(tài)制劑產(chǎn)品提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 10周齡海蘭褐雞來源于河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)院。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的采集及處理 選取10周齡海蘭褐雞，分為健康雞、非健康和服用過微生態(tài)制劑(主要益生菌為枯草芽孢桿菌，糞腸球菌，屎腸球菌)3組，每組選20只，選取的腸段為十二指腸，空腸、盲腸，各腸斷取約10 cm長度，稱其重量，剪碎，分別放入盛有100 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，用恒溫培養(yǎng)搖床搖20 min(120 r/min)[6-7]。

1.2.2 細菌基因組DNA提取 挑取單菌落到5 mL盛有LB和MRS液體培養(yǎng)基的PA瓶中，30 ℃活化3-4 h，培養(yǎng)液稍渾濁，取1 mL加入1.5 mL滅菌離心管中，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，再加1 mL STE懸浮菌體，12 000 r/min離心1 min，棄上清。向收集的菌體中加入100 μL TE，沸水煮10 min，立即冰浴10 min，離心5 min取上清液即為DNA模板，將基因組DNA放于-20 ℃，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 目的基因的擴增與測序 細菌16S rDNA 基因序列的擴增采用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTG-ATCCTGGCTCAG-3′)和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進行PCR擴增。PCR擴增體系(40 μL)：以提取的細菌基因組DNA為模板2 μL，上游引物(27 F)1 μL，下游引物(1 541 R)1 μL，Taq酶20 μL，ddH2O 16 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃復性1 min，28個循環(huán)，72 ℃延伸10 min,擴增產(chǎn)物4 ℃保存，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。觀察1 500 bp目的片段的條帶是否擴增出來。凡是擴增成功的PCR產(chǎn)物都送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 16S rDNA 序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 將測序成功的菌株序列，選取10～1 500 bp序列，輸入到韓國的EzTaxon-e數(shù)據(jù)庫(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)中的Identify程序，然后對所得的16S rDNA 基因序列進行菌株相似性信息比對，挑選出與其同源性最高的標準菌株序列。然后用Clustal X 軟件將菌株測序出來的基因序列和標準菌株序列進行比對，利用MEGA6軟件，采用鄰接法構(gòu)建菌株間的系統(tǒng)發(fā)育樹，了解菌株的遺傳進化信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 健康海藍褐雞腸道細菌多樣性及系統(tǒng)進化分析 本試驗從健康海蘭褐雞的不同腸道中共分離到30株細菌，經(jīng)16S rDNA 基因序列比對后獲得16種不同的細菌，結(jié)果如表1。

表1 健康海蘭褐雞腸道細菌16S rDNA序列鑒定結(jié)果

由表1可知，從健康雞的腸道中共分離到16種不同細菌，分屬8個不同屬，其中屬于乳酸桿菌屬的有4個，分別為乳酸桿菌、羅伊氏乳酸桿菌、卷曲乳桿菌、唾液乳桿菌，占25%；屬于芽孢桿菌屬的有3個，分別為特基拉芽孢桿菌、Bacillussiamensis、枯草芽孢桿菌，占19%；屬于腸球菌屬的有3個，分別為耐久腸球菌、乳酸腸球菌、糞腸球菌，占19%；屬于大腸埃希菌屬的有2個，分別為阿爾伯蒂埃希桿菌、大腸埃希菌，占13%；屬于不動桿菌屬的有1個，為谷氨酸不動桿菌；屬于葡萄球菌屬的有1個，為葡萄球菌；屬于巨球菌屬的有1個，為Macrococcuscaseolyticus；屬于志賀菌屬的有1個，為Shigellaflexneri，各占6%，由此可見，在健康雞的腸道中乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬和腸球菌屬為優(yōu)勢微生物，其中絕大多數(shù)為國家農(nóng)業(yè)部公布的益生菌名錄中的益生菌。

采用Clustal X 軟件將分離出來的16株菌株的16S rDNA 基因序列和標準菌株序列進行比對，利用MEGA6軟件，采用鄰接法構(gòu)建菌株間的系統(tǒng)發(fā)育樹，了解菌株的遺傳進化信息，健康海蘭褐雞腸道微生物系統(tǒng)進化結(jié)果如圖1。

由圖1可以看出從健康雞的腸道中共分離到16種不同的細菌被聚類成三大分枝，其中腸球菌屬和乳酸桿菌屬聚類為第一分枝，絕大多數(shù)芽孢桿菌聚類為第二分枝，而其余的細菌聚類為第三分枝，因此，從細菌種類結(jié)構(gòu)來說，健康海蘭褐雞腸道微生物主要為乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬和腸球菌屬，它們?yōu)榻】岛Ｌm褐雞腸道中為優(yōu)勢菌。

2.2 非健康海蘭褐雞腸道微生物多樣性及系統(tǒng)進化分析 從非健康海蘭褐雞不同腸道中共分離到15株細菌，經(jīng)16S rDNA 基因序列比對后獲得10種不同的細菌，結(jié)果如表2。

圖1 健康海蘭褐雞腸道微生物系統(tǒng)發(fā)育進化樹

表2 得病海蘭褐雞腸道細菌16S rDNA序列鑒定結(jié)果

由表2可知，非健康海蘭褐雞的腸道中共分離到10種不同細菌，從種屬結(jié)構(gòu)來看，10種不同細菌分為8個不同屬，其中屬于志賀菌屬的有2個，為鮑氏志賀菌、痢疾志賀菌，占20%；屬于克雷伯菌的有2個，分別為肺炎克雷伯菌、Klebsiellaquasipneumoniae，占20%；屬于腸球菌屬的有1個，為糞腸球菌，占10%；屬于腸桿菌屬的有1個，為路德維希腸桿菌，占10%；屬于氣單胞菌屬的有1個，為Aeromonasbestiarum，占10%；屬于埃希菌屬的有1個，為弗氏埃希菌，占10%；屬于乳酸桿菌屬的有1個，為羅伊氏乳酸桿菌，占10%；屬于巨型桿菌屬的有1個，為巨型球菌，占10%；由此可見，在非健康雞腸道中志賀菌屬和克雷菌屬為優(yōu)勢細菌。

采用Clustal X 軟件將分離出來的10株菌株的16S rDNA 基因序列和標準菌株序列進行比對，利用MEGA6軟件，采用鄰接法構(gòu)建菌株間的系統(tǒng)發(fā)育樹，非健康海蘭褐雞腸道細菌系統(tǒng)進化結(jié)果如圖2。

圖2 非健康海蘭褐雞腸道細菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹

由圖2可以看出，從得病海蘭褐雞的腸道中共分離到10種不同的細菌被聚類成2大分枝，其中第1分枝7株細菌屬于變形桿菌門，占70%，第2分枝3株細菌屬于厚壁菌門，占30%，因此，從細菌種類結(jié)構(gòu)來說，非健康海蘭褐雞腸道細菌主要為變形桿菌門的細菌。

2.3 飼喂微生態(tài)制劑的海蘭褐雞腸道細菌多樣性及系統(tǒng)進化分析 從飼喂過混合微生態(tài)制劑2周的健康海蘭褐雞的腸道中共分離到19株細菌，經(jīng)16S rDNA 基因序列比對后獲得14種不同的細菌，結(jié)果如表3。

表3 服用過微生態(tài)制劑的海蘭褐雞腸道細菌16S rDNA序列鑒定結(jié)果

由表3可知，從飼喂過微生態(tài)制劑的海蘭褐雞腸道中共分離到14株不同的細菌，從種屬層面來看，14株不同的細菌分屬12個不同的屬，其中屬于腸球菌屬的有3個，分別為糞腸球菌、海氏腸球菌、屎腸球菌，占21%；屬于芽孢桿菌屬的有2個，Bacillussiamensis和賴氨酸芽孢桿菌，占14%；屬于檸檬酸桿菌屬的有1個，為檸檬酸桿菌；屬于氣單胞菌屬的有1個，為氣單胞菌；屬于不動桿菌屬的有1個，為谷氨酸不動桿菌；屬于金黃桿菌屬的有1個，為Chryseobacteriumginsengisoli；屬于葡萄球菌屬的有1個，為葡萄球菌；屬于寡養(yǎng)單胞菌屬的有1個，為Stenotrophomonaspavanii；屬于乳酸桿菌屬的有1個，為唾液乳桿菌；屬于志賀菌屬的有1個，為弗氏志賀菌；屬于克雷伯菌屬的有1個，為肺炎克雷伯菌，各占7%，由此可見，在飼喂微生態(tài)制劑的雞的腸道中腸球菌屬和芽孢桿菌為優(yōu)勢細菌，其中糞腸球菌、屎腸球菌、唾液乳桿菌及芽孢桿菌為益生菌。飼喂過微生態(tài)制劑的海蘭褐雞腸道細菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖3所示。

圖3 飼喂微生態(tài)制劑海藍褐雞腸道細菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹

由圖3可以看出，從飼喂微生態(tài)制劑海蘭褐雞的腸道中共分離到14種不同的細菌被聚類成3大分枝，其中第1分枝7株細菌為變形桿菌門，第2分枝5株細菌為厚壁菌門，第3分枝1株細菌為擬桿菌門(Bacteroidetes)，從細菌種群結(jié)構(gòu)來說，飼喂微生態(tài)制劑海蘭褐雞腸道細菌種類更多。

3 結(jié)論

3.1 從微生物種群結(jié)構(gòu)來看，健康海藍褐雞腸道中共分離到16種不同微生物，分屬厚壁菌門(Firmicutes)和變形桿菌門(Proteobacteria)，其中厚壁菌門占75%，變形桿菌門占25%，厚壁菌門占優(yōu)勢；從種屬層面來看，優(yōu)勢微生物為乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬和腸球菌屬的微生物，分別占25%、19%、19%。非健康海蘭褐雞的腸道中共分離到10種不同微生物，分屬變形桿菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)，其中變形桿菌門占70%，厚壁菌門(Firmicutes)占30%，變形菌門占優(yōu)勢；從種屬層面來看，優(yōu)勢微生物為志賀菌屬和克雷菌屬，分別占20%、20%。飼喂過微生態(tài)制劑的海蘭褐雞腸道中共分離到14株不同的微生物，主要分布在變形桿菌門(Proteobacteria)占57%，厚壁菌門(Firmicutes)占36%，擬桿菌門(Bacteroidetes)占7%，從種屬層面看，優(yōu)勢微生物為腸球菌屬和芽孢桿菌，分別占21%和14%。

3.2 糞腸球菌、乳酸桿菌、志賀菌在不同健康狀態(tài)的海蘭褐雞腸道中都存在，腸球菌為兼性厭氧菌，屎腸球菌和糞腸球菌都廣泛分布在各個腸段。乳酸桿菌屬于有益菌，是動物健康不可缺少的要素，可以合成各種維生素，參與食物消化。而志賀菌是細菌性痢疾最為常見的病原菌，能夠引起拉稀、腹瀉等癥狀。其中健康狀態(tài)和飼喂微生態(tài)制劑的海蘭褐雞腸道微生物以腸球菌屬和乳酸桿菌屬為主，而患病的海蘭褐雞的腸道微生物以志賀菌為主，也說明飼喂微生態(tài)制劑對調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)，增強腸道有益微生物數(shù)量,提高動物腸道健康有重要意義。