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    犬利什曼原蟲病例報(bào)告

    2019-05-16 02:34:20劉宏鋒張偉偉
    中國(guó)獸醫(yī)雜志 2019年11期
    關(guān)鍵詞:杜氏原蟲嬰兒

    單 敏 , 安 娜 , 劉宏鋒 , 張偉偉 , 劉 欣

    (1.聯(lián)寵國(guó)際檢測(cè)中心 , 北京 海淀 100089 ; 2.美聯(lián)眾合動(dòng)物醫(yī)院轉(zhuǎn)診中心 , 北京 朝陽(yáng) 100012)

    利什曼原蟲(Leishmaniaspp.)屬于錐體蟲科利什曼蟲屬的原蟲,該原蟲會(huì)引起人及多種動(dòng)物利什曼病,是一種重要的人獸共患病。利什曼原蟲主要感染對(duì)象包括蹄兔目、嚙齒目、犬科和人類。該病發(fā)展緩慢,具有一定的潛伏期,臨床表現(xiàn)為不規(guī)則發(fā)熱,肝脾腫大,漸進(jìn)性貧血和血漿球蛋白升高等。利什曼原蟲的生活史包括前鞭毛體和無(wú)鞭毛體2個(gè)時(shí)期。前者寄生于節(jié)肢動(dòng)物(白蛉或羅蛉)的消化道內(nèi),后者寄生于哺乳動(dòng)物的巨噬細(xì)胞內(nèi),通過(guò)白蛉叮咬傳播。目前全世界有88個(gè)國(guó)家報(bào)告過(guò)利什曼原蟲癥的病例,威脅健康人數(shù)達(dá)3.5億[1]。我國(guó)關(guān)于利什曼原蟲感染的病例報(bào)道較少,本文就2例犬利什曼原蟲感染病例介紹如下。

    1 病例情況

    1.1 病例1 雄性泰迪犬,2歲。注射狂犬疫苗后,出現(xiàn)脫毛,厭食,身體消瘦,發(fā)熱等臨床癥狀。右側(cè)肩胛部大片脫毛,被覆大量白色結(jié)痂,四肢及眼周存在少量結(jié)痂,皮膚與黏膜結(jié)合處輕微破潰結(jié)痂。

    1.2 病例2 雌性雜種犬,1歲。最初表現(xiàn)為打噴嚏,2周后出現(xiàn)鼻出血,發(fā)熱癥狀,后又出現(xiàn)便血癥狀。體格檢查發(fā)現(xiàn)下頜淋巴結(jié)及腘淋巴結(jié)腫大。

    2 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

    2.1 血常規(guī)及血液生化檢測(cè) 病例1及病例2均顯示動(dòng)物存在貧血(見(jiàn)表1),血液生化結(jié)果顯示,兩例患犬球蛋白水平顯著升高(見(jiàn)表2)。

    2.3 顯微鏡觀察 對(duì)病例1體表結(jié)節(jié)及病例2淋巴結(jié)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查,均可見(jiàn)巨噬細(xì)胞內(nèi)存在大量的利什曼原蟲無(wú)鞭毛體結(jié)構(gòu)(見(jiàn)中插彩版圖1及圖2)。

    圖1 病例1體表結(jié)節(jié)細(xì)胞學(xué)檢查(Diff-Quik染色,1 000×)

    圖2 病例2淋巴結(jié)細(xì)胞學(xué)檢查(Diff-Quik染色,1 000×)

    表1 血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

    表2 生化檢測(cè)結(jié)果

    2.4 PCR檢測(cè)和分型

    2.4.1 目的基因PCR擴(kuò)增 將病例1的皮膚刮取物、淋巴組織和病例2的血液樣本送至聯(lián)寵國(guó)際檢測(cè)中心進(jìn)行PCR鑒定。聯(lián)寵國(guó)際檢測(cè)中心對(duì)臨床收集的病例1和病例2樣本分別提取基因組DNA,隨后用利什曼原蟲的18S rDNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將樣品PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳,電泳條帶大小為602 bp(見(jiàn)圖3和圖4),與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符,證實(shí)為利什曼原蟲。

    圖3 病例1 18S rDNA基因PCR鑒定
    M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ; 1: 病例1 ; N: 陰性對(duì)照

    2.4.2 序列測(cè)定和分型 為進(jìn)一步對(duì)利什曼原蟲分型,將用18S rDNA引物擴(kuò)增的目的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast序列比對(duì),比對(duì)結(jié)果與杜氏、嬰兒和恰氏利什曼原蟲的同源性為100%,再次表明該病例為利什曼原蟲病。為進(jìn)一步確診利什曼原蟲的分型,用LGITSF2/LGITSR2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[2],PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示,獲得約400 bp的特異性片段(見(jiàn)圖5和圖6),與預(yù)期擴(kuò)增的片段大小(372~450 bp)相符。之后將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì),用于區(qū)分杜氏和嬰兒/恰氏利什曼原蟲兩種亞型(見(jiàn)圖7)。經(jīng)比對(duì)表明病例1和病例2均為嬰兒/恰氏利什曼原蟲感染。

    圖4 病例2 18S rDNA基因PCR鑒定
    M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ; 2:病例2 ; N:陰性對(duì)照

    圖5 病例1 LGITS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定
    M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ; 1: 病例1 ; N: 陰性對(duì)照

    圖6 病例2 LGITS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定
    M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ; 2:病例2 ; N:陰性對(duì)照

    圖7 基因片段序列1801269064-A:病例1LGITS基因片段序列 ;1803089981-B:病例2LGITS基因片段序列

    3 治療

    根據(jù)臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確,診該兩犬患有利什曼原蟲病后,采用別嘌呤醇(10~20 mg/kg·bw,每天2次,口服,連用6-18個(gè)月)和米替福新(2 mg/kg·bw,每天1次,與食物同時(shí)口服,連用4周)進(jìn)行治療。

    4 治療結(jié)果

    經(jīng)過(guò)治療后,病例1和病例2臨床癥狀均有緩解,血常規(guī)檢測(cè)各項(xiàng)結(jié)果均在正常參考范圍內(nèi),血液生化檢測(cè)結(jié)果顯示,球蛋白水平高于正常水平(表3)。

    表3 生化檢測(cè)結(jié)果

    5 討論

    在我國(guó)人群中主要流行杜氏利什曼原蟲,杜氏利什曼原蟲是黑熱病的病原。犬源型的病原為嬰兒利什曼原蟲,且犬的感染率高,人的感染大都來(lái)自病犬,散在發(fā)生[3]。1990年WHO利什曼病專家委員會(huì)將杜氏利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲和恰氏利什曼原蟲三者視為杜氏利什曼原蟲復(fù)合體[4]?,F(xiàn)許多學(xué)者將嬰兒利什曼原蟲和恰氏利什曼原蟲視為同一型[3]。

    利什曼原蟲的感染機(jī)制復(fù)雜,所致臨床癥狀存在較大差異[5]。犬感染利什曼原蟲潛伏期可長(zhǎng)達(dá)6周-7年,早期逐漸發(fā)病,癥狀不典型,主要以發(fā)熱、脾臟、淋巴結(jié)病變?yōu)橹鱗6]。蟲體侵入機(jī)體后主要引起多臟器感染,并引起消瘦、食欲不振、沉郁、咳嗽等臨床癥狀,皮膚病變特征為過(guò)度角質(zhì)化、增厚、皮屑以及皮膚、黏膜的潰瘍。

    經(jīng)檢測(cè)病例1和病例2出現(xiàn)血細(xì)胞減少和血漿球蛋白升高等癥狀,初步符合利什曼原蟲病臨床癥狀。針對(duì)利什曼原蟲的檢測(cè)最早主要是基于細(xì)胞學(xué)檢查,觀察到原蟲就即可確診[3]。經(jīng)顯微鏡觀察,在病例1和病例2的巨噬細(xì)胞內(nèi)均存在大量的利什曼原蟲無(wú)鞭毛體。但當(dāng)宿主體內(nèi)蟲體量較低時(shí)細(xì)胞學(xué)檢查可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

    在利什曼原蟲檢測(cè)方法中,PCR技術(shù)具有較高的靈敏性和特異性[7]。已有研究表明,PCR法可對(duì)血液中的利什曼原蟲特異DNA片段進(jìn)行高效擴(kuò)增檢測(cè),具有病原學(xué)診斷的意義,且能通過(guò)片段序列比對(duì)分析致病蟲種[8]。本病例中,用LGITSF2/LGITSR2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序,2只患犬的測(cè)序結(jié)果與嬰兒利什曼原蟲病的同源性為100%。

    犬利什曼原蟲病的主要感染源來(lái)自于病犬,無(wú)論是感染利什曼原蟲的犬還是人類,較長(zhǎng)的潛伏期及不明顯的臨床癥狀,都使臨床上出現(xiàn)較多的誤診的情況。PCR法檢測(cè)方法具有較高的敏感性和特異性,能高效地發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀犬或感染犬,有助于較好的指導(dǎo)犬利什曼原蟲病的預(yù)防控制工作。

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