小鼠腦內(nèi)細胞色素P450 17A1神經(jīng)元定位

李 強 ， 科爾沁滿來 ， 李鵬輝 ， 張 雪 ， 范奎奎 ， 海日罕 ， 杜晨光,

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 ， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018 ； 2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學職業(yè)技術學院 ， 內(nèi)蒙古 包頭 014109)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成類固醇激素(如雌激素和雄激素)參與調(diào)解生殖、能量代謝及內(nèi)分泌等多種功能[1]。腦內(nèi)的神經(jīng)元細胞、星形膠質(zhì)細胞以及少突膠質(zhì)細胞內(nèi)均有以膽固醇為起始物類固醇激素酶類的合成，且合成過程需要一系列酶類參與，如細胞色素P450 17A1(CYP17A1)、類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白以及3B羥基類固醇脫氫酶1在類固醇合成過程中具有積極作用[2]。

細胞色素P450超家族血紅素混合功能氧化酶調(diào)節(jié)多種生理功能，包括其類似藥物以及外源性物質(zhì)對于激素和維生素生物合成的影響[3]。細胞色素P450 17A1是其家族中的一員，在類固醇激素合成過程中起到關鍵作用，調(diào)節(jié)前體物(膽固醇)轉(zhuǎn)化為鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素或性激素等，同時也是具有多重性功能的酶，可催化17α羥基化反應以及17,20裂解反應[4]。

由于CYP17A1可催化類固醇激素的合成及代謝，因而在目前的許多研究中都將其作為治療類固醇激素相關疾病的關鍵點，涉及內(nèi)分泌紊亂、肥胖、以及肥胖引發(fā)的高血壓、糖尿病等[5]。有文獻證實CYP17A1可間接影響腦內(nèi)其他蛋白的表達，從而調(diào)節(jié)相應生理功能[6]，提示CYP17A1與類固醇激素參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能。目前研究主要集中在睪丸、卵巢、腎上腺等組織，鮮有CYP17A1在腦內(nèi)有表達的報導。為此，本試驗檢測了小鼠腦組織內(nèi)CYP17A1神經(jīng)元分布，為研究其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能存在功能提供神經(jīng)學證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠，購自北京維通利華生物科技有限公司，經(jīng)自群繁育后(避免近交)，獲得適應現(xiàn)有飼養(yǎng)條件的7周齡雄性小鼠(n=6),體重23～25 g。

1.2 方法

1.2.1 組織獲取和保存 用于免疫熒光試驗的小鼠(n=6)經(jīng)3 %戊巴比妥鈉深度麻醉，使用灌注泵經(jīng)心肺以3 mL/min灌注5 min生理鹽水約15 mL，后分別以5 mL/min灌注固定液(4 %多聚甲醛)40 min約200 mL，取各組小鼠腦組織置于固定液中后固定過夜，修塊后轉(zhuǎn)移至30 %蔗糖溶液中直至完全沉降。使用冰凍切片機對腦組織冠狀面連續(xù)切片，厚度為30 μm，漂片法洗滌，4 ℃保存，并加入疊氮化鈉(NaN3)防腐。

1.2.2 免疫熒光 使用冰凍切片機包埋劑(OCT，SLEE)包埋脫水后的腦組織，于冰凍切片機(SLEE MNT)連續(xù)切片，厚度為30 μm，按順序置于0.02 mol/L PBS(pH值=7.4)的12孔板內(nèi)。選取不同位置腦片經(jīng)(1%triton+0.4%SDS+PBS) 4 ℃搖床(80 r/min)預處理4 h。3%標準驢血清(NDS)室溫(29 ℃)封閉1 h，4 ℃過夜孵育一抗(CYP17A1，兔單克隆，1∶200，Abcam ab125022)、然后室溫孵育二抗2 h (ALexa647, 驢抗兔；1∶2 000, Abcam ab150075)。每步結束后用PBS清洗3次，每次10 min。然后將切片整齊的貼于載玻片，待其完全干燥后，激光共聚焦(Nikon C2)647波段進行掃描。

2 結果

CYP17A1熒光信號存在于小鼠腦內(nèi)特定神經(jīng)核團，呈廣泛性分布。根據(jù)小鼠腦3D圖譜并結合小鼠腦立體定位圖譜(見中插彩版圖1A-D)， CYP17A1在小鼠腦內(nèi)各區(qū)域的分布如下。

前腦：CYP17A1熒光信號形態(tài)清晰飽滿，集中分布在內(nèi)臟區(qū)(VISC，見中插彩版圖1J)、軀體感覺區(qū)(SSs，見中插彩版圖1H)，在主要體覺區(qū)(SSp，見中插彩版圖1H)、海馬、丘腦室旁核(PVT，見中插彩版圖1G)、脾后區(qū)(RSP)等處有零散分布，其他區(qū)域未見表達。

下丘腦區(qū)：CYP17A1熒光信號在下丘腦室旁核(PVN，見中插彩版圖1F)、下丘腦腹內(nèi)側核(VMH，見中插彩版圖1L)處呈明顯區(qū)域性分布。下丘腦外側區(qū)(LHA，見中插彩版圖1K)有較為分散的陽性信號。其他區(qū)域亦見零星分布(見中插彩版圖1E-L)。

后腦腦干：CYP17A1熒光信號在蝸腹側核后部(VCO，見中插彩版圖1T)、藍斑(LC，見中插彩版圖1N)、舌下神經(jīng)核(12N，見中插彩版圖1V)、外側網(wǎng)狀核(LRNm，見中插彩版圖1X)中有豐富表達。巨細胞網(wǎng)狀核(GRN，見中插彩版圖1O/P)、臂旁核(PB，見中插彩版圖1R)等核團中亦見少量零散分布(見中插彩版圖1M-X)。

圖1 小鼠腦內(nèi)CYP17A1熒光信號的分布小鼠腦形態(tài)模擬圖(A-D)，下丘腦室旁核(PVN, E,F)，下丘腦腹內(nèi)側核(VMH, L),下丘腦外側區(qū)(LH, I,K)，內(nèi)臟區(qū)(VISC, I,J)，

3 討論

目前未見小鼠腦內(nèi)CYP17A1神經(jīng)元分布的報道。本試驗檢測了CYP17A1在小鼠腦內(nèi)的分布，結果表明，CYP17A1神經(jīng)元在小鼠腦內(nèi)多個核團均有表達，如下丘腦的PVN、VMH、LHA核團及腦干內(nèi)的LC、NTS、12N等區(qū)域均檢測到CYP17A1神經(jīng)元分布。上述區(qū)域與已報到的類固醇類激素或受體的分布吻合，推測CYP17A1可能在這些區(qū)域內(nèi)調(diào)節(jié)類固醇激素的合成及其功能的發(fā)揮。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在著各類細胞集合而成的大量核團和神經(jīng)纖維，可接收來自機體各處信息，通過下丘腦-垂體-性腺軸反饋作用進而調(diào)節(jié)機體的內(nèi)分泌活動。類固醇類激素(如雌激素及雄激素)在調(diào)節(jié)生殖及能量代謝平衡中發(fā)揮重要作用，睪酮可在CYP17A1等酶的作用下轉(zhuǎn)化為雌二醇。嚙齒類及靈長類動物腦中有雌二醇和睪酮及其受體的廣泛分布，雌激素受體(ER)及雄激素受體(AR)被認為是細胞對雌激素和雄激素應答的媒介。雌激素受體主要分布在間腦視前區(qū)、中腦間核及下丘腦的弓狀核、室旁核、腹內(nèi)側核，雌二醇作為主要的雌激素與其受體結合后，可降低母雞的產(chǎn)蛋量、蛋的受精率及公雞的產(chǎn)精能力[7]；在去勢大鼠腦組織中雌二醇可影響G蛋白偶聯(lián)雌激素受體的表達[8]；雄激素受體主要分布在丘腦內(nèi)包括弓狀核、腹、背側核和室旁核等處，睪酮與雄激素受體結合對機體產(chǎn)生一些列調(diào)控作用，包括可直接通過下丘腦-垂體軸調(diào)節(jié)垂體中黃體生成素和卵泡刺激素的釋放[8]。

同時CYP17A1在體內(nèi)的表達亦受多種因素的調(diào)節(jié)，如食欲素B影響豬子宮中CYP17A1的表達、敲除Mamld1可減少小鼠睪丸腫瘤細胞中CYP17A1的表達、蛋白激酶C在腎上腺中可抑制CYP17A1的表達[9]。提示通過調(diào)節(jié)特定區(qū)域中CYP17A1的活性，可對生殖、內(nèi)分泌及某些疾病的預防和治療起到積極意義。

綜上，結合類固醇激素在腦內(nèi)核團中的作用，推測CYP17A1在小鼠腦內(nèi)與調(diào)節(jié)相關類固醇激素合成及功能的發(fā)揮積極相關。