青海大通北川河源區(qū)魚類舌狀絳蟲和雙線絳蟲的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究

伊平昌 ， 李國(guó)平 ， 顧冬花 ， 趙志剛 ， 張成圖 ， 盧福山

(1.青海省大通縣畜牧獸醫(yī)站 ， 青海 西寧 810199 ； 2.青海省西寧市畜牧獸醫(yī)站 ，青海 西寧 810005 ； 3.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院 ， 青海 西寧 810016)

青海大通北川河源區(qū)國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于青海省西寧市大通縣境內(nèi)，湟水河一級(jí)支流-北川河源頭，海拔2 680～4 622 m，保護(hù)區(qū)涉及寶庫(kù)、青林、青山、向化、樺林共5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，總面積約10.79萬(wàn)公頃，占大通縣總面積的34.91%[1-2]。青海大通北川河源區(qū)國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)特殊的植被和復(fù)雜的地理環(huán)境，為這里的魚種提供了豐富的食物來(lái)源，使魚類資源順利繁衍生息。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)青海大通北川河源區(qū)內(nèi)魚類寄生的絳蟲進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，確定為舌狀絳蟲和雙線絳蟲，進(jìn)一步豐富了魚類動(dòng)物的生物多樣性，為魚類資源保護(hù)和絳蟲病防治提供了理論依據(jù)和防治資料。

1 材料與方法

1.1 蟲體采集 本試驗(yàn)于2016年8月至2017年7月，分別按季節(jié)在青海大通北川河源區(qū)主要河流段(北緯N37°17′，東經(jīng)E101°09′)將捕獲的367尾魚類樣本進(jìn)行解剖，用挑蟲針鉤取扁平長(zhǎng)帶狀、不分節(jié)、乳白色“面條樣”蟲體(見(jiàn)中插彩版圖1)，用0.9%的生理鹽水沖洗干凈后，置于70%酒精甘油中保存，備用。

圖1 “面條樣”蟲體標(biāo)本
a ： 舌狀絳蟲 ； b ： 雙線絳蟲

1.2 引物 所用引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 PCR分子生物學(xué)鑒定所用引物

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 剪取各0.5 cm3大小形態(tài)的蟲體組織塊分別放入新的保存管中，用剪刀剪碎組織，利用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作步驟按照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行，DNA置于-20 ℃長(zhǎng)期保存。

1.3.2 PCR鑒定 兩種蟲體的CoxI、ItsI和NadI基因引物參考Zehnder等[3]基因的引物和基于在NCBI上下載絳蟲的序列，經(jīng)Genedoc軟件比對(duì)后，利用Primer3 Input (Version 0.4.0)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。為保險(xiǎn)起見(jiàn)，將目的片段分兩個(gè)部分上下引物擴(kuò)增后，進(jìn)行PCR分子生物學(xué)鑒定。PCR擴(kuò)增酶為天根生化科技(北京)有限公司的蛋白酶K，擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：Mastrer Mix 25.0 μL，上、下游引物(濃度10 μmol/L)各2 μL，模板DNA 7 μL，重蒸餾水19 μL至PCR反應(yīng)體系為50 μL(均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司)。為了避免試劑是否存在污染，每組PCR均設(shè)立不含模板的空白對(duì)照來(lái)檢測(cè)。擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳(電壓120 V，時(shí)間30 min)，電泳完成后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果并拍照。目的條帶的膠塊采用DNA膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行膠回收。

1.3.3 序列分析 陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成，采用Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)峰圖分析后，在GenBank上用采用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)方法進(jìn)行同源序列搜索，應(yīng)用MEGA 5.10軟件和Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在線軟件進(jìn)行分析核苷酸序列和氨基酸序列的同源性。

1.3.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 通過(guò)NCBI提供的BLAST在線搜索服務(wù)軟件下載其他舌狀絳蟲和雙線絳蟲的CoxI、ItsI和NadI核苷酸基因序列。利用MEGA 5.10軟件的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建功能對(duì)這些基因序列進(jìn)行分析，選擇鄰近法(Neighbor-Joining method，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用自展值(Bootstrap)檢驗(yàn)其可靠性，重復(fù)次數(shù)為2 000，分析不同分離株絳蟲間的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 PCR分子鑒定 利用基因組DNA提取試劑盒提取DNA后，基于CoxI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出約480 bp的目的片段；基于ItsI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增出1 500 bp的目的片段；同樣基于NadI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增出500 bp的目的片段；分別得到了3條目的基因片段(與預(yù)期的目的條帶長(zhǎng)度相符)，目的條帶的膠塊進(jìn)行膠回收、測(cè)序。所得序列在GenBank用BLAST進(jìn)行同源序列搜索，結(jié)果表明,兩種樣品經(jīng)分子鑒定為舌關(guān)絳蟲(Ligulaintestinalis)和雙線絳蟲(Digrammainterupta)。

2.2 基因同源性對(duì)比分析 用Clustal Omega在線軟件的Clustal 2.1方法，將2種蟲體克隆序列(CoxI、ItsI和NadI基因序列)進(jìn)行研究鑒定，與已上傳到GenBank上的舌狀絳蟲(Ligulaintestinalis)和雙線絳蟲(Digrammainterupta)核苷酸序列分別進(jìn)行同源性比較，見(jiàn)表2、表3。結(jié)果表明，舌狀絳蟲的CoxI基因序列與EU241312 (法國(guó))和EU241317(法國(guó))的核苷酸序列同源性分別為97.8%和97.3%，ItsI基因序列與KC900973 (伊朗)和KC900974(伊朗)的核苷酸序列同源性分別為95.1%和99.3%，NadI基因序列與AF524046 (中國(guó))、AF524043 (中國(guó))、AF524044 (中國(guó))和AF524045 (中國(guó))的核苷酸序列同源性分別為84.2%、83.4%、69.9%和69.6%；雙線絳蟲的CoxI基因序列與EU241317 (法國(guó))、EU241287(法國(guó))、 EU241309 (法國(guó))和EU241281(法國(guó))的核苷酸序列同源性分別為78.3%、78.6%、79.6%和78.6%，ItsI基因序列與KC900973 (伊朗)和KC900974 (伊朗)的核苷酸序列同源性分別為96.0%和98.9%，NadI基因序列與AF524045 (中國(guó))、AF524043 (中國(guó))、AF524044 (中國(guó))和AF524023 (中國(guó))的核苷酸序列同源性分別為84.6%、67.0%、67.6%和99.5%。這兩種蟲體在GenBan中進(jìn)行同源性比較分析發(fā)現(xiàn)，不同線粒體基因標(biāo)記顯示出的物種差異性較大，且沒(méi)有1條DNA序列與它們有100%的同源性。本研究鑒定的分離株Ligulaintestinalis和Digrammainterupta與伊朗(KC900974)分離株及中國(guó)分離株(AF524023)序列同源性較高，并被發(fā)現(xiàn)鑒定。

表2 舌狀絳蟲3種不同基因與其參考序列的核苷酸序列的同源性比較

表3 雙線絳蟲3種不同基因與其參考序列的核苷酸序列的同源性比較

2.3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析 選取GenBank已發(fā)表的相應(yīng)序列運(yùn)用MEGA 5.10中的鄰近法(Neighbor-Joining method，NJ)構(gòu)建兩種蟲體包含分離株的3種基因(CoxI、ItsI和NadI基因)的相應(yīng)進(jìn)化樹(圖2～7)。結(jié)果表明，本研究鑒定的舌狀絳蟲分離株與伊朗分離株種屬親緣關(guān)系較近，與其他絳蟲所屬分支相隔較遠(yuǎn)，與李偉平等[4]研究的結(jié)果相一致；雙線絳蟲分離株與我國(guó)分離株種屬親緣關(guān)系較近，在進(jìn)化上與其他地區(qū)的分離株遺傳進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。從進(jìn)化樹的分支狀況發(fā)現(xiàn)，舌狀絳蟲和雙線絳蟲雖然存在分支跨越，但均聚在一個(gè)大的分支上，與其他屬種明顯分開(kāi)。

2.3.1 舌狀絳蟲進(jìn)化分析

2.3.1.1 基于舌狀絳蟲CoxI基因?qū)Σ煌N類絳蟲遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹見(jiàn)圖2。根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)育樹判斷與法國(guó)同屬一支，和中國(guó)本土遺傳體系較為接近。

2.3.1.2 基于舌狀絳蟲ItsI基因?qū)Σ煌N類絳蟲遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹見(jiàn)圖3。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹可判斷其遺傳體系為獨(dú)立的一支。

2.3.1.3 基于舌狀絳蟲NadI基因?qū)Σ煌N類絳蟲遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹見(jiàn)圖4。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹判斷其與中國(guó)本土遺傳體系同屬一支，與日本、韓國(guó)遺傳體系較為接近。

圖2 基于CoxI基因序列以鄰近法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)

圖3 基于ItsI基因序列以鄰近法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)

圖4 基于NadI基因序列以鄰近法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)

2.3.2 雙線絳蟲進(jìn)化分析

2.3.2.1 基于雙線絳蟲CoxI基因?qū)Σ煌N類絳蟲遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹見(jiàn)圖5?？膳袛喑雠c法國(guó)同屬一支，遺傳體系較為接近。

圖5 基于CoxI基因序列以鄰近法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)

2.3.2.2 基于雙線絳蟲ItsI基因?qū)Σ煌N類絳蟲遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹見(jiàn)圖6?？膳袛喑鲭p線絳蟲ItsI基因?yàn)楠?dú)立的一支遺傳體系。

圖6 基于ItsI基因序列以鄰近法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 (NJ樹)

2.3.2.3 基于雙線絳蟲NadI基因?qū)Σ煌N類絳蟲遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹見(jiàn)圖7。可判斷出與中國(guó)本土的遺傳體同屬一支，絳蟲屬遺傳體系較為接近。

3 討論

本研究利用3個(gè)線粒體CoxI、ItsI和NadI基因進(jìn)行了舌狀絳蟲和雙線絳蟲的分子鑒定。線粒體基因是區(qū)別不同地域絳蟲及其幼蟲的標(biāo)識(shí)基因，應(yīng)運(yùn)最廣的為CoxI基因與NadI基因[5]，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)青海大通北川河源區(qū)魚類絳蟲種屬內(nèi)對(duì)比鑒定分析，發(fā)現(xiàn)舌狀絳蟲的差異性為6%～8%，雙線絳蟲為8%～10%，兩者皆可作為遺傳研究的標(biāo)記。兩種蟲體序列間分析發(fā)現(xiàn)CoxI基因變異程度高于NadI基因，其中舌狀絳蟲CoxI基因片段中45個(gè)變異位點(diǎn)上存在堿基的倒置、轉(zhuǎn)換和缺失，而在雙線絳蟲的33個(gè)變異位點(diǎn)上堿基均缺失。兩種蟲體種屬內(nèi)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)CoxI基因的差異性達(dá)到11%以上，在NCBI-Blast中檢索得到的其他絳蟲作比對(duì)，差異性達(dá)6%～8%，與大通地區(qū)的地理位置和蟲體寄生有關(guān)。在ItsI基因種屬內(nèi)對(duì)比發(fā)現(xiàn)差異性較其他兩個(gè)基因片段較小，能有效地識(shí)別亞種內(nèi)的物種，在NCBI-Blast中檢索得到的其他絳蟲比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其同源性很高，而差異性小，在系統(tǒng)發(fā)育樹上兩種蟲體的ItsI基因均作為獨(dú)立的一支。從進(jìn)化樹的分支狀況可以發(fā)現(xiàn)，舌狀絳蟲和雙線絳蟲雖然存在分支跨越，但是均聚在一個(gè)大的分支上，與其他屬種明顯分開(kāi)。這些結(jié)果表明，CoxI和ItsI基因均可用于舌狀絳蟲和雙線絳蟲種的系統(tǒng)發(fā)育研究。

圖7 基于 NadI 基因序列以鄰近法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 (NJ樹)

利用以基因?yàn)榉肿訕?biāo)記進(jìn)行鑒定研究，豐富了寄生蟲的鑒定方法，促進(jìn)了寄生蟲分類的發(fā)展[4]。相對(duì)于核基因組來(lái)說(shuō)，線粒體基因組具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因排列緊密、嚴(yán)格母系遺傳、進(jìn)化速率較快和無(wú)組織特異性等特點(diǎn)，特別適合作為遺傳學(xué)研究的標(biāo)記[6]。通過(guò) DNA 序列、蛋白質(zhì)序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，用類似樹狀分支的圖來(lái)表示各種(類)生物之間的親緣關(guān)系，通過(guò)對(duì)生物序列的研究來(lái)推測(cè)物種的進(jìn)化歷史。

本試驗(yàn)對(duì)我國(guó)青海大通北川河源區(qū)國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)河流中魚類體內(nèi)感染的舌狀絳蟲(Ligulaintestinalis)和雙線絳蟲(Digrammainterupta)的CoxI、NadI和ItsI基因序列進(jìn)行克隆測(cè)序并進(jìn)行了分子鑒定；同時(shí)，運(yùn)用CoxI、NadI和ItsI3種基因進(jìn)行了屬種之間的分子系統(tǒng)發(fā)育初步探究，比較了主要蟲種間基因的序列同源性，得到了系統(tǒng)發(fā)育樹，初步闡明了鑒定種與其他種屬之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。