昆明系小鼠腸炎沙門菌感染的診治

牟澤華 , 孔垂民 , 劉文華 , 劉煥奇

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

實驗動物在生物科學(xué)的研究發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，確保選用的實驗動物健康，是動物實驗成功的首要前提。小鼠作為實驗動物的重要組成部分，廣泛的應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域[1]。昆明系小鼠有著抗病力和適應(yīng)性強，繁殖率存活率高的特點，是我國生產(chǎn)量、使用量最大的遠交群小鼠。

沙門菌為革蘭陰性桿菌，種類繁多，分布廣泛，有些為動物疾病病原，有些為人獸共患病病原，是世界范圍內(nèi)最主要的食源性病原之一，侵害動物后發(fā)生敗血癥、胃腸炎、局部炎癥[2]。腸炎沙門菌感染以腹瀉和流產(chǎn)為特征?，F(xiàn)如今對于沙門菌的檢測技術(shù)較多，如免疫分析技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、 納米技術(shù)等[3]，這些技術(shù)提高了檢測的效率和準確率，為沙門菌的防治工作提供了保障。

2018年6月，某實驗動物養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的昆明系小鼠出現(xiàn)大范圍死亡現(xiàn)象，小鼠腹瀉消瘦、食欲減退，體重不達標，雌鼠繁殖能力下降，流產(chǎn)，產(chǎn)死胎。通過實驗室檢測，確診該養(yǎng)殖場的小鼠感染了沙門菌，具體診治過程如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源及主要試劑 某實驗動物養(yǎng)殖場送檢健康的昆明系小鼠10只。PCR試劑，購自TaKaRa公司。

1.2 臨床診斷 送檢的小鼠禁食24 h后，脫頸處死，70%酒精浸泡消毒后對小鼠進行剖檢觀察。

1.3 細菌的分離與鑒定

1.3.1 細菌的分離 無菌采集小鼠的肝臟，脾臟，子宮干酪樣內(nèi)容物，分別接種于普通培養(yǎng)基及S.S.培養(yǎng)基中。37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，然后利用S.S.培養(yǎng)基對可疑菌落進行3代純化。

1.3.2 細菌的鏡檢 挑取純化的單菌落，進行革蘭染色，利用光學(xué)顯微鏡觀察細菌形態(tài)。

1.3.3 細菌的PCR鑒定 挑取分離純化的單菌落，利用煮沸法提取DNA作為模板，參照Oliveira，S.D等[4]針對沙門菌invA基因的特異性引物以及16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增，具體反應(yīng)條件見表1。為了從種的水平鑒定沙門菌，將擴增的與預(yù)期片段大小一致的16S rRNA基因片段的PCR產(chǎn)物送往上海派森諾生物股份有限公司進行測序。測序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對。

表1 PCR反應(yīng)引物序列和反應(yīng)條件

1.4 動物回歸試驗 隨機將健康的昆明系小鼠分為2組，每組5只。挑取純化的單菌落，LB搖菌過夜，生理鹽水調(diào)整菌液濃度1×109CFU/mL，試驗組小鼠腹腔注射0.2 mL菌液，對照組小鼠腹腔注射0.2 mL無菌生理鹽水。觀察小鼠臨床癥狀。

1.5 紙片擴散法藥敏試驗 對不同組織分離純化的菌株經(jīng)LB搖菌過夜，菌液進行常規(guī)的紙片擴散法藥敏試驗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的病理變化 剖檢患病小鼠可見小鼠肝臟腫大，邊緣有白色區(qū)域性壞死灶、可見出血點。脾臟顯著出血，充血，顯著腫大，大小為正常小鼠脾臟的2～3倍，質(zhì)脆，呈藍紫色(見中插彩版圖1)。子宮壁增厚，粗糙，可見干酪樣內(nèi)容物(見中插彩版圖2)。

圖1 患病小鼠肝、脾腫大

圖2 子宮干酪樣滲出物

2.2 細菌的分離與鏡檢 在患病小鼠的肝臟、脾臟、子宮內(nèi)容物均分離到細菌，細菌在普通培養(yǎng)基上生長良好，為中等大小無色半透明菌落，在S.S.培養(yǎng)基上菌落呈黑色。革蘭染色鏡檢，菌體顯示為兩端鈍圓的中等大小的革蘭陰性桿菌。

2.3 細菌的PCR測定及分析比對結(jié)果 以沙門菌的特異性引物進行的PCR擴增獲得了預(yù)期284 bp的目的條帶，結(jié)合培養(yǎng)特性確認該分離株為沙門菌。16S rRNA基因通用引物的PCR擴增獲得了預(yù)期900 bp的目的條帶。PCR電泳結(jié)果如圖3所示。

圖3 PCR檢測結(jié)果
M：DL-2 000 ； 1、8：肝臟分離株 ； 2、9：脾臟分離株 ；3、10：子宮內(nèi)容物分離株 ； 4、7：陽性對照 ； 5、6：陰性對照

將測序獲得的16S rRNA基因序列在GenBank進行BLAST比對，結(jié)果表明不同組織中分離的沙門菌擴增得到的基因序列與腸炎沙門菌的同源性均達100%，所以判定分離的沙門菌為腸炎沙門菌。

2.4 動物回歸試驗 對健康的昆明系小鼠攻毒后，試驗組小鼠6 h后就出現(xiàn)精神沉郁癥狀，8 h后出現(xiàn)死亡，12 h后攻毒小鼠全部死亡。對照組小鼠無任何癥狀。剖檢試驗組小鼠，可見肝脾與對照組相比明顯腫大，并從死亡小鼠肝脾中分離到了沙門菌。

2.5 藥敏試驗 分離的沙門菌進行紙片擴散法藥敏試驗，根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)動物源細菌藥敏試驗標準，判斷菌株的敏感性，結(jié)果見表2。

由表2可知，不同組織中分離菌株的藥敏試驗結(jié)果基本相同，普遍對頭孢類藥物、鹽酸左氧氟沙星、磷霉素鈣顯示高度敏感；對氨基糖苷類藥物、氟苯尼考中度敏感；對林可霉素、硫酸黏霉素、鹽酸多西環(huán)素等耐藥。

2.6 治療效果 根據(jù)藥敏試驗結(jié)果及藥物配伍原則，選擇頭孢他啶與鹽酸左氧氟沙星進行聯(lián)合用藥。用藥3 d后全群不再有死亡，用藥5 d病情得到有效控制。

3 討論

各種年齡的動物均可感染腸炎沙門菌，但該菌最常侵害幼年和青年動物，使其發(fā)生敗血癥、腹瀉及產(chǎn)生局部炎癥及流產(chǎn)癥狀[2]。送檢的小鼠通過剖檢發(fā)現(xiàn)，小鼠肝脾顯著腫脹、出血，子宮內(nèi)呈明顯的干酪樣炎癥，有流產(chǎn)不孕現(xiàn)象。這些表現(xiàn)符合腸炎沙門菌感染的臨床癥狀。沙門菌多經(jīng)過消化道感染健康動物，但送檢小鼠，子宮炎癥非常明顯，說明腸炎沙門菌除引起消化道癥狀外，也可引起生殖道感染。

表2 分離菌株的藥敏試驗

S表示高度敏感 ； I表示中度敏感 ； R表示耐藥

通過動物回歸試驗發(fā)現(xiàn)小鼠在攻毒后6 h就出現(xiàn)臨床癥狀，8 h小鼠出現(xiàn)死亡，說明該菌具有極強的致病性，由于小鼠死亡迅速，小鼠主要的病理變化為肝脾充血、腫脹，子宮及胃腸道癥狀不明顯。藥敏試驗表明，本試驗分離到的菌株對革蘭陰性菌有作用的抗生素耐藥性較差，基本表現(xiàn)為中等敏感或敏感，說明抗生素治療效果會比較顯著。

傳統(tǒng)的生化試驗及血清學(xué)鑒定方法用于細菌的鑒別診斷步驟繁瑣，耗時較長，不利于疾病的快速診斷，分子生物學(xué)以其快速敏感準確的特點目前被廣泛用于疾病的檢測[5]。本試驗首先通過菌落及菌體形態(tài)初步懷疑為沙門菌感染，然后利用沙門菌的特異性引物及16S rRNA基因的通用引物對提取的DNA進行擴增，雙管齊下，確保了診斷的正確率。

患病鼠及帶菌鼠是主要傳染源，環(huán)境污穢、潮濕、鼠房擁擠、營養(yǎng)不良等是誘發(fā)本病的主要因素[6]。通過詢問養(yǎng)殖人員發(fā)現(xiàn)，換水及換墊料的頻率低，飼養(yǎng)室內(nèi)外、墊料等消毒不徹底，養(yǎng)殖密度嚴重超標，這些不規(guī)范的養(yǎng)殖模式是疾病發(fā)生的主要誘因，同時患病鼠間通過交配進一步擴大了感染范圍。

雖然通過敏感藥物治療控制了病情，由于實驗動物的特殊性，藥物治療并非首選，養(yǎng)殖過程中，加強對病原感染的防范才是關(guān)鍵。對于沙門菌的防控要做到以下幾點：一是引進種鼠要進行隔離檢疫，健康方可混群和使用；二是堅持衛(wèi)生消毒制度，定期對小鼠房舍及飼養(yǎng)用具進行消毒；三是墊料嚴格消毒，保證墊料干燥，房舍通風(fēng)，并嚴防野鼠出入；四是保持適宜的飼養(yǎng)密度，避免密度過大導(dǎo)致環(huán)境氨氮濃度超標而誘發(fā)呼吸道疾病；五是保證飼養(yǎng)人員健康，發(fā)現(xiàn)疫情及時匯報，對淘汰患病小鼠采取無害化處理。如果疫情不能完全得到控制，建議全群淘汰，全面消毒后，重新引種[7]。