乳腺癌中DEAH盒解旋酶16的表達(dá)及臨床意義

莊瑩，張淑紅，樊偉平，趙小芳，孫海燕，劉爽 ，張虎

（1. 江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生化教研室，江蘇 鹽城 224005；2. 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物教研室，黑龍江 佳木斯 154007；3. 江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院護(hù)理學(xué)院內(nèi)科護(hù)理教研室，江蘇 鹽城 224005）

乳腺癌是較為常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年乳腺癌發(fā)病數(shù)占世界總數(shù)的12.2%，每年因乳腺癌死亡的病例數(shù)占世界總數(shù)的9.6%，且發(fā)病率和新發(fā)病例數(shù)目前仍在增加［1］。隨著生活水平的提高，人們對(duì)預(yù)后的關(guān)注度也在提升。DEAH盒解旋酶16 （DEAH-box helicase 16，DHX16）是一種蛋白質(zhì)編碼基因，與主要組織相容性抗原同樣定位于染色體6p21.3，此區(qū)域與腫瘤的發(fā)生和自身免疫疾病相關(guān)［2］。但是，DHX16在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用多組學(xué)高通量數(shù)據(jù)，分析DHX16在乳腺癌中的表達(dá)情況及表達(dá)變化相關(guān)因素，為乳腺癌臨床研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

通 過(guò) 癌 癥 基 因 組 學(xué) 分 析 網(wǎng) 站cBioPortal［3-4］（http：//www.cbioportal.org） 、癌癥芯片數(shù)據(jù)庫(kù)UALCAN［5］（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html） 、癌癥多組學(xué)數(shù)據(jù)平臺(tái)LinkedOmics［6］（http：//www.linkedomics.org），分析乳腺癌組織中DHX16基因表達(dá)變化、基因表達(dá)變化相關(guān)因素及其臨床意義。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

1.2.1 mRNA水平變化與基因甲基化相關(guān)性的研究方法：登錄cBioPortal首頁(yè)，選擇實(shí)時(shí)更新的TCGA浸潤(rùn)性乳腺癌患者數(shù)據(jù)集，分析 DHX16 基因突變、拷貝數(shù)變化、mRNA水平變化以及 DHX16 高表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。分析 DHX16 mRNA水平變化時(shí)，選擇RNA測(cè)序，并選擇默認(rèn)閾值“DHX16：EXP≥2 or DHX16：EXP≤-2”下載分析結(jié)果；進(jìn)一步使用該網(wǎng)站分析 DHX16 高表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，mRNA水平變化與DHX16基因甲基化的相關(guān)性。

1.2.2 基因表達(dá)變化與癌癥分型相關(guān)性的研究方法：登錄TCGA門(mén)戶網(wǎng)站UALCAN首頁(yè)，點(diǎn)擊“Analysis”，輸入基因名稱“DHX16”，選擇TCGA dataset“Breast invasive carcinoma”，檢索，點(diǎn)擊“Expression”，記錄結(jié)果。利用GraphPad 6.0軟件作圖，統(tǒng)計(jì)方法為t檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 mRNA水平變化與基因拷貝數(shù)變化相關(guān)性的研究方法：登錄LinkedOmics首頁(yè)，癌癥組選擇“TCGA_BRCA”，檢索數(shù)據(jù)集選擇“HiSeq RNA”，輸入目標(biāo)基因“DHX16”，目標(biāo)數(shù)據(jù)集選擇“Clinical”，統(tǒng)計(jì)方法選擇“Non-parametric T test”，提交，在分析結(jié)果中選擇“P ＜ 0.05”的臨床相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析；使用該網(wǎng)站分析DHX16 mRNA水平變化與DHX16基因拷貝數(shù)變化相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHX16在乳腺癌患者中表達(dá)的變化及其與預(yù)后的關(guān)系

對(duì)1 093例乳腺癌患者樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，12%的患者DHX16 mRNA表達(dá)上調(diào) （圖1A） ；16%的患者DHX16基因發(fā)生改變，包括基因擴(kuò)增、缺失、錯(cuò)義突變、mRNA下調(diào)或上調(diào) （圖1B） ；且DHX16高表達(dá)不利于乳腺癌預(yù)后 （P = 0.004） （圖1C） ；浸潤(rùn)性乳腺癌中DHX16基因表達(dá)較正常乳腺組織顯著增加（P ＜ 0.001） （圖1D） 。

圖1 DHX16在乳腺癌患者中表達(dá)的變化及其與預(yù)后的關(guān)系Fig.1 Changes in DHX16 expression in breast cancer patients and its relationship with prognosis

2.2 乳腺癌患者中DHX16基因表達(dá)變化與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

乳腺癌患者中DHX16基因表達(dá)在不同PAM50分子亞型、種族、病理分期、M分期、T分期中表達(dá)有差異 （均P ＜ 0.05） 。見(jiàn)圖2。

2.3 DHX16基因拷貝數(shù)變化及甲基化影響其表達(dá)

圖2 DHX16基因表達(dá)與各臨床指標(biāo)的關(guān)系Fig.2 Correlation between DHX16 gene expression and clinical findings

結(jié)果顯示，DHX16拷貝數(shù)變化和DHX16 mRNA水平呈正相關(guān) （r = 0.56，P ＜ 0.05） （圖3A） ；DHX16基因甲基化水平和DHX16 mRNA水平呈負(fù)相關(guān) （r =-0.32，P ＜ 0.05） （圖3B） 。

圖3 乳腺癌患者DHX16基因甲基化和拷貝數(shù)變化對(duì)mRNA水平的影響Fig.3 Effect of DNA methylation and copy number variation on DHX16 mRNA levels in breast cancer

3 討論

乳腺癌是中國(guó)女性患病率最高的惡性腫瘤之一，近年來(lái)確診人數(shù)一直在增加［7］。隨著乳腺癌診斷和治療水平不斷提高，患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量得到了初步改善。由于其發(fā)病機(jī)制目前仍未完全揭示，因此預(yù)后改善程度難以滿足臨床需要［8］。本研究首次發(fā)現(xiàn)DHX16基因在乳腺癌組織中高表達(dá)，提示該分子參與乳腺癌發(fā)生與進(jìn)展。本研究對(duì)其進(jìn)行初步研究，為臨床乳腺癌預(yù)后提供新的思路。

DHX16屬于DEAD/H盒解旋酶家族［9］。該家族成員與多種惡性腫瘤及自身免疫性疾病相關(guān)［10］。DHX16具有ATP結(jié)合RNA解旋酶活性，參與細(xì)胞周期的進(jìn)展和人類前體mRNA剪接過(guò)程［9］，DHX16的缺失可導(dǎo)致前體mRNA滯留在細(xì)胞核內(nèi)，無(wú)法進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯［11］。另外有文獻(xiàn)［12］報(bào)道，DHX16通過(guò)影響mRNA剪接過(guò)程，在肺癌發(fā)展中起重要作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)DHX16高表達(dá)不利于乳腺癌預(yù)后，其原因可能是DHX16高表達(dá)可調(diào)節(jié)癌基因前體mRNA的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)出核并表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展，不利于乳腺癌預(yù)后。

對(duì)DHX16表達(dá)與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者DHX16表達(dá)與PAM50不同分子亞型相關(guān)，Basal型乳腺癌患者的DHX16表達(dá)水平最高，其次是LumB型、Her2型和LumA型乳腺癌患者。乳腺癌患者DHX16表達(dá)受種族的影響，表達(dá)具有種族特異性。乳腺癌患者DHX16表達(dá)與乳腺癌病理分期相關(guān)，隨著分期增加表達(dá)上升，提示DHX16高表達(dá)可能促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展。乳腺癌患者DHX16表達(dá)與乳腺癌M分期相關(guān)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M1期高于M0期，提示DHX16高表達(dá)可能促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。乳腺癌患者DHX16表達(dá)與乳腺癌T分期相關(guān)，隨著腫瘤直徑增大表達(dá)上升，提示DHX16高表達(dá)可能與細(xì)胞增殖相關(guān)。

基因拷貝數(shù)增加通常會(huì)引起基因表達(dá)上升［13］，本研究發(fā)現(xiàn)DHX16表達(dá)水平與其基因拷貝變化正相關(guān)。異常的啟動(dòng)子DNA過(guò)度甲基化通常是導(dǎo)致基因沉默的調(diào)節(jié)因素之一，有研究［14］報(bào)道DNA甲基化影響乳腺癌的基因表達(dá)譜，從而影響乳腺癌的分型，同時(shí)也被作為某些癌癥治療的靶點(diǎn)。本研究中，DHX16基因甲基化水平與其表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明DNA低甲基化促進(jìn)了DHX16的表達(dá)。

本研究運(yùn)用多組學(xué)高通量數(shù)據(jù)庫(kù)分析乳腺癌患者樣本，基于數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)大、隨訪時(shí)間長(zhǎng)、組學(xué)數(shù)據(jù)完備，DHX16高表達(dá)不利于乳腺癌患者預(yù)后這一結(jié)果的可信度高，可作為乳腺癌預(yù)后的一個(gè)潛在標(biāo)志物。但研究也存在一些不足，如分析結(jié)果受到樣本來(lái)源的限制。后續(xù)研究中，本課題組會(huì)在更多臨床乳腺癌患者樣本中驗(yàn)證DHX16的表達(dá)差異，并進(jìn)一步研究DHX16參與乳腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制。