青蛤（Cyclinasinensis）ERK基因的克隆及其在PolyI：C刺激下的表達(dá)分析

侯梓園 石雅峰 姚遠(yuǎn) 潘寶平 閆春財(cái)

摘要[目的]研究青蛤（Cyclinasinensis）ERK基因的克隆及在PolyI：C刺激下的表達(dá)情況。[方法]在已建立的青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選得到青蛤細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellularregulatedproteinkinases）基因類似序列。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件在線對該基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。采用PCR技術(shù)克隆基因，并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)克隆得到CsERK基因在青蛤5個不同組織中的表達(dá)情況及在干擾素誘導(dǎo)劑PolyI：C的刺激下ERK基因在青蛤血淋巴中的時(shí)序性表達(dá)情況。[結(jié)果]ERK基因序列全長為2407bp，開放閱讀框長1338bp，共編碼445個氨基酸。ERK基因在青蛤的血淋巴、外套膜、閉殼肌、肝臟和鰓5個組織中均表達(dá)，在血淋巴中表達(dá)量最高，閉殼肌中表達(dá)量最低。青蛤ERK基因在PolyI：C脅迫下表達(dá)量在6h時(shí)達(dá)到最大值，與對照組相比差異極顯著（P<0.01）。[結(jié)論]ERK基因所指導(dǎo)合成的蛋白是青蛤重要的免疫信號通路蛋白。

關(guān)鍵詞青蛤;ERK基因;PolyI：C;熒光定量PCR

中圖分類號S944.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0099-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.031

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

青蛤（Cyclinasinensis）是一種常見的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類，其食用味道好而且具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，青蛤養(yǎng)殖是我國海產(chǎn)品養(yǎng)殖的支柱型產(chǎn)業(yè)，青蛤本身具有重要的藥用價(jià)值[1]。但是隨著近年來我國水產(chǎn)行業(yè)大環(huán)境的惡化，青蛤在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)了大規(guī)模的病害和死亡現(xiàn)象，給近海地區(qū)的經(jīng)濟(jì)帶來了巨大的損失[2]。對青蛤的健康養(yǎng)殖、抗病害機(jī)制及免疫調(diào)控的研究迫在眉睫，這一研究不僅可以為解決青蛤在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的死亡現(xiàn)象提供初步的理論研究結(jié)果，而且可以為進(jìn)一步研究青蛤及其他無脊椎動物的免疫方式積累重要的試驗(yàn)依據(jù)。

Toll樣受體（tolllikereceptors，TLR）是原始且保守的免疫系統(tǒng)受體之一[3]。Toll樣受體信號通路主要用于調(diào)控一些參與免疫的蛋白表達(dá)。細(xì)胞外刺激作用于細(xì)胞需要通過MAPK信號介導(dǎo)的三級激酶級聯(lián)反應(yīng)[4]。而細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellularregulatedproteinkinases，ERK）是MAPK家族中的一員，它是將信號從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵。在脊椎動物中已有ERK基因的相關(guān)研究，但ERK基因在軟體動物中的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。

聚肌胞苷酸（polyinosinic：polycytidylicacid，PolyI：C）是一種人工合成的雙鏈RNA，可模擬病毒進(jìn)行試驗(yàn)[5]。作為一種高效的誘導(dǎo)劑，聚肌胞苷酸可在魚類等海產(chǎn)品及臨床醫(yī)學(xué)的小鼠模型研究中作為病毒類似物進(jìn)行侵染試驗(yàn)。該試驗(yàn)中，通過PolyI：C體外注射得到ERK干擾后的基因，以其為模板測定表達(dá)量的變化。

免疫生物學(xué)研究是水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害防治的理論基礎(chǔ)。青蛤只具有先天性免疫系統(tǒng)，而抗生素的使用會使生物產(chǎn)生抗藥性。所以，研究貝類免疫相關(guān)因子的作用機(jī)制在發(fā)展水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中刻不容緩。免疫增強(qiáng)劑的研發(fā)和使用將在極大程度上發(fā)揮貝類的先天特異性免疫調(diào)節(jié)功能，大大提高貝類抵御病原體的能力，對水環(huán)境保護(hù)、貝類增養(yǎng)殖業(yè)以及水產(chǎn)品衛(wèi)生安全等都具有重要的意義[6]。

1材料與方法

1.1材料

青蛤采購于天津王頂?shù)毯ｕr品市場，暫養(yǎng)于密度1.02～1.04g/cm3的中性海水中，持續(xù)供氧，水溫22℃左右[7]，投喂5‰小球藻。飼喂大約7d，選取體表完好、個體形態(tài)差別較小的青蛤[平均殼寬（19.12±0.56）mm、平均殼長（29.13±1.22）mm、平均殼高（29.51±1.46）mm]進(jìn)行分組試驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1材料處理。

在注射前選取若干青蛤，提取血淋巴、鰓、肝臟、閉殼肌、外套膜組織約50mg冷凍備用;配置濃度約為1μg/g的PolyI：C[8]。將余下青蛤隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組，每組設(shè)置3個平行。在試驗(yàn)組青蛤的閉殼肌部位中注射PolyI：C50μL，在對照組青蛤中注射等量滅菌海水。分別在注射后的0、3、6、12、24、48、96h提取青蛤的血淋巴。準(zhǔn)確稱取各組織50mg，冷凍于液氮中備用。

1.2.2青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建。

將提取的青蛤6個組織于液氮中研磨充分后，置于1mLTrizol中提取組織的總RNA。按照QIAGEN公司的OligotexmRNAKits法分離純化總RNA。用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄法將純化后的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將得到的cDNA末端修飾、加尾等，用以制備整個文庫。采用Unigene編碼蛋白框ORF預(yù)測分析去冗余后的數(shù)據(jù)，再經(jīng)Blast分析后，從中篩選得到青蛤ERK基因類似序列。再利用篩選得到的青蛤ERK基因類似序列進(jìn)行克隆，設(shè)計(jì)克隆時(shí)所用引物CsERK-F1、CsERK-R1（表1）。

1.2.3生物信息學(xué)分析。

基因克隆產(chǎn)物與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BlastX（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）分析[9]，利用開放閱讀框（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線分析軟件分析其開放閱讀框，使用SignalP3.0分析該基因的信號肽序列，利用SMART（http：∥smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測結(jié)構(gòu)域，ProtParam工具在線預(yù)測此序列的分子量、分子式和等電點(diǎn)，使用ClustalW對氨基酸序列進(jìn)行同源性分析和多重比對[10]。

1.2.4ERK基因在青蛤各組織內(nèi)的表達(dá)。

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