組織培養(yǎng)條件下紫色松乳菇培養(yǎng)條件的優(yōu)化

王 歡，欒竹青，劉傳林，龔雪琴，由翠榮，梁麗琨

（煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺 264005）

菌根（Mycorrhiza） 是由真菌和植物根系形成的共生體[1]。侵染植物根系通過長期作用形成菌根的一類真菌稱為菌根性真菌。松乳菇（Laclarius deliciosus） 是一種很有開發(fā)價值的外生菌根真菌[2]，春、秋季單生或群生于針葉林下，常與松科植物共生形成外生菌根。外生菌根能加強(qiáng)植物對水分和礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收，并為植物提供多種植物激素、維生素、脂肪酸等代謝產(chǎn)物，促進(jìn)植物生長[3-7]。松乳菇子實(shí)體含有較多粗脂肪、粗蛋白和人體必需氨基酸，質(zhì)脆味美，藥食兩用，具有抗腫瘤和抗菌等功效，深受人們喜愛。但是由于松乳菇子實(shí)體發(fā)育特定共生關(guān)系等因素的影響，目前只能依賴于野生或半人工栽培，而不能人工規(guī)模種植，因此具有很大的研究空間[8-9]。為保護(hù)和合理開發(fā)利用這一珍貴食用菌資源，探索松乳菇的人工栽培技術(shù)具有重要意義。

目前，菌根性食用菌的半人工栽培技術(shù)逐漸成熟，該技術(shù)中如何提高菌根合成率和穩(wěn)定性是研究重點(diǎn)[10-11]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以在實(shí)驗(yàn)室條件下迅速獲得大量松樹無菌苗，研究組織培養(yǎng)條件下松樹無菌苗與菌根性食用菌的共侵染能力和侵染條件，提高菌根合成能力，有望使松乳菇人工栽培成為可能。

植物組織培養(yǎng)的條件一般不利于菌根真菌的生長，因此研究組織培養(yǎng)條件下松乳菇的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件是共侵染及菌根合成研究的前提。

試驗(yàn)以改良的1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基[12]，采用單因素試驗(yàn)研究組織培養(yǎng)條件下適合松乳菇菌絲生長的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，為松乳菇與黑赤松無菌苗的侵染建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

采集于山東省煙臺市昆崳山的松乳菇子實(shí)體，經(jīng)過組織分離并鑒定保存的純菌種。

1.1.2 基本培養(yǎng)基

1/2 MS離子[13]，200 g/L土豆，20 g/L葡萄糖，100 mg/L肌醇，100 mg/L酪蛋白，5.5 g/L瓊脂，pH值6.0。于115℃下滅菌30 min。

1.2 種子的制備

1.2.1 液體種子的制備

活化于固體基本培養(yǎng)基的菌種，無菌條件在菌落邊緣切取邊長約0.8 cm的菌絲塊8～10塊，接種于盛有80 mL基本液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，靜置1 d，25℃下以轉(zhuǎn)速120 r/min遮光搖床培養(yǎng)，每隔3 d更換新鮮培養(yǎng)基。連續(xù)2次換液后選用直徑約2 mm的菌絲球作為液體種子。

1.2.2 固體菌種的制備

活化于固體基本培養(yǎng)基的菌種，無菌操作于菌落邊緣切取邊長約1.5 cm的菌絲塊，接種于固體基本培養(yǎng)基上，每瓶接種4塊，于25℃下遮光培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 液體培養(yǎng)基最適糖源的篩選

分別用20 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉和乳糖替換基本培養(yǎng)基中的葡萄糖，以10%的接種量接種液體種子，每組處理5個平行，3次重復(fù)試驗(yàn)。于25℃下，以轉(zhuǎn)速120 r/min搖床遮光培養(yǎng)14 d，測定菌絲球的干質(zhì)量。

1.3.2 液體培養(yǎng)基最適糖源質(zhì)量濃度的篩選

以5種糖類質(zhì)量濃度（10，15，20，25，30 g/L）分別替換基本培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度，以10%的接種量接種液體種子，每組處理5個平行，3次重復(fù)試驗(yàn)。于25℃下，以轉(zhuǎn)速120 r/min搖床遮光培養(yǎng)14 d，測定菌絲干質(zhì)量。

1.3.3 液體培養(yǎng)基最適接種量的篩選

分別以接種量6%，8%，10%，12%，14%接種液體種子于液體基本培養(yǎng)基中，每組處理5個平行，3次重復(fù)試驗(yàn)。于25℃下，以轉(zhuǎn)速120 r/min搖床遮光培養(yǎng)14 d，測定菌絲干質(zhì)量。

1.3.4 液體培養(yǎng)基最適裝液量的篩選

分別以5種裝液量70，75，80，85，90 mL將基本培養(yǎng)基分別裝于250 mL的錐形瓶中，以10%的接種量接種液體種子，每組處理5個平行，3次重復(fù)試驗(yàn)。于25℃下，以轉(zhuǎn)速120 r/min搖床遮光培養(yǎng)14 d，測定菌絲干質(zhì)量。

1.3.5 最適液體培養(yǎng)條件下生長曲線的測定

以最適接種量接種液體種子于優(yōu)化的液體培養(yǎng)基中，于25℃下，以轉(zhuǎn)速120 r/min搖床遮光培養(yǎng)16 d，每天取3瓶測定菌絲干質(zhì)量，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，菌絲干質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.3.6 固體培養(yǎng)基最適糖源的篩選

分別用20 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉和乳糖替換基本培養(yǎng)基中的葡萄糖，用無菌打孔器切取固體種子的邊緣位置接種固體基本培養(yǎng)基，每瓶接種1塊，每組處理5個平行，3次重復(fù)試驗(yàn)。于25℃下遮光培養(yǎng)14 d，采用垂直交叉法測量菌落直徑，并觀察菌絲生長情況。

1.3.7 固體培養(yǎng)基最適糖源質(zhì)量濃度的篩選

分別以質(zhì)量濃度10，15，20，25，30 g/L替換基本培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度，用無菌打孔器切取固體種子的邊緣位置接種固體基本培養(yǎng)基，每瓶接種1塊，每組處理5個平行，3次重復(fù)試驗(yàn)。于25℃下遮光培養(yǎng)14 d，采用垂直交叉法測量菌落直徑，并觀察菌絲生長情況。

1.3.8 最適固體培養(yǎng)條件下生長曲線的測定

用無菌打孔器切取固體種子的邊緣位置接種優(yōu)化的固體培養(yǎng)基，每瓶接種1塊，于25℃下遮光培養(yǎng)16 d。每天測量菌落直徑，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、菌落直徑日增長量為縱坐標(biāo)繪制曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖源種類對松乳菇液體培養(yǎng)的影響

分別用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉和乳糖替換基本培養(yǎng)基中的葡萄糖，于25℃下以轉(zhuǎn)速120 r/min搖床遮光培養(yǎng)14 d，測量菌絲干質(zhì)量。

使用不同糖源松乳菇液體培養(yǎng)的菌絲干質(zhì)量見圖1。

圖1 使用不同糖源松乳菇液體培養(yǎng)的菌絲干質(zhì)量

從圖1可看出，在其他條件相同的情況下，紫色松乳菇對5種糖類都可利用，但利用程度不同。在含葡萄糖的培養(yǎng)基中，菌絲生長旺盛、菌絲球潔白，菌絲干質(zhì)量達(dá)0.68 g，約為其他糖類的2倍，因此葡萄糖最適合松乳菇液體培養(yǎng)。其次是麥芽糖，菌絲球密度較大、生長良好；可溶性淀粉不易分解難以直接利用，且易產(chǎn)生沉淀；紫色松乳菇利用率最低的是乳糖，菌絲球密度較低、菌絲干質(zhì)量僅0.27 g。

周國英等人[14]對松乳菇菌絲深層液體培養(yǎng)營養(yǎng)因子及培養(yǎng)條件的研究表明，最適碳源為葡萄糖，硫酸鎂和氯化鈉可以加速啟動生長，磷酸二氫鉀使菌絲產(chǎn)量提高。周傳云等人[15]對松乳菇液態(tài)培養(yǎng)工藝及其飲料配方的研究表明，最佳培養(yǎng)基配方各添加量為麩皮汁4%，葡萄糖4%，蔗糖3%，馬鈴薯汁25%，米糠汁5%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%。

2.2 糖源質(zhì)量濃度對松乳菇液體培養(yǎng)影響

分別用質(zhì)量濃度10，15，20，25，30 g/L替換基本培養(yǎng)基中葡萄糖，于25℃下以轉(zhuǎn)速120 r/min搖床遮光培養(yǎng)14 d，測量菌絲干質(zhì)量。

不同糖源質(zhì)量濃度松乳菇液體培養(yǎng)的菌絲干質(zhì)量見圖2。

圖2 不同糖源質(zhì)量濃度松乳菇液體培養(yǎng)的菌絲干質(zhì)量

由圖2可知，不同糖源質(zhì)量濃度對松乳菇液體培養(yǎng)菌絲生物量有影響。糖源質(zhì)量濃度過低不能滿足菌絲生長的需求造成菌絲生長緩慢；而糖源質(zhì)量濃度過高則會導(dǎo)致培養(yǎng)液黏稠度增大、降低溶解氧濃度，不利菌絲生長。在以葡萄糖為糖源的培養(yǎng)基中，松乳菇菌絲生物量隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加呈先增后降的趨勢，在25 g/L時達(dá)到最大值。

2.3 松乳菇液體培養(yǎng)的最適接種量

分別以6%，8%，10%，12%，14%接種量接種液體種子于液體基本培養(yǎng)基中，25℃下以轉(zhuǎn)速120 r/min搖床遮光培養(yǎng)14 d，測量菌絲干質(zhì)量。

不同接種量松乳菇液體培養(yǎng)的菌絲干質(zhì)量見圖3。

圖3 不同接種量松乳菇液體培養(yǎng)的菌絲干質(zhì)量

適宜的接種量可使菌種利用營養(yǎng)物質(zhì)快速生長，獲得大量的菌絲球。接種量過低，菌絲生長緩慢，在生長周期內(nèi)無法獲得期望的生物量；接種量過高，定量的營養(yǎng)物質(zhì)無法滿足菌絲的生長要求，菌絲產(chǎn)生的代謝廢物大量積累，也會對菌絲的生長造成威脅。從圖3可看出，接種量為12%時，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大值。

2.4 松乳菇液體培養(yǎng)基的最適裝液量

分別用70，75，80，85，90 mL替換基本培養(yǎng)基中的裝液量，于25℃下以轉(zhuǎn)速120 r/min搖床遮光培養(yǎng)14 d，測量菌絲干質(zhì)量。

不同裝液量松乳菇液體培養(yǎng)的菌絲干質(zhì)量見圖4。

圖4 不同裝液量松乳菇液體培養(yǎng)的菌絲干質(zhì)量

裝液量對菌絲的生長有一定影響。裝液量過少，每次獲得的菌絲生物量也少，并且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，培養(yǎng)液易變黏稠；裝液量過多，無法滿足菌絲生長所需要的供氧量，不利于菌絲的生長。從圖4可看出，隨著裝液量的增加，菌絲干質(zhì)量也在增加，在裝液量為90 mL時達(dá)到最大值。

2.5 松乳菇在最適液體培養(yǎng)條件下的生長

以12%的接種量接種液體種子于優(yōu)化的液體培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，菌絲干質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制曲線。

松乳菇在最適液體培養(yǎng)條件下的生長曲線見圖5。

圖5 松乳菇在最適液體培養(yǎng)條件下的生長曲線

從圖5可看出，松乳菇液體種子接種到優(yōu)化的液體培養(yǎng)基后，先開始一段延滯期，這一時期菌絲適應(yīng)新生長環(huán)境，合成生長所需要的各種酶或輔酶等；從5 d開始進(jìn)入快速生長期，這一時期，營養(yǎng)物質(zhì)充足、代謝旺盛、外部環(huán)境穩(wěn)定、菌絲生長量達(dá)最大值；之后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌絲干質(zhì)量趨于穩(wěn)定，這一時期一般4 d左右；穩(wěn)定期過后進(jìn)入衰亡期，因?yàn)橥獠凯h(huán)境的變化和代謝廢物的積累造成菌體老化、自溶，菌絲球由白色變?yōu)辄S色、菌絲生物量下降、培養(yǎng)液變渾濁。

2.6 糖源種類對松乳菇固體培養(yǎng)影響

分別用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉和乳糖替換基本培養(yǎng)基中的葡萄糖，25℃下遮光培養(yǎng)14 d，測量菌落直徑。

糖源種類對松乳菇固體培養(yǎng)的影響見圖6，不同糖源對松乳菇菌絲生長的影響見圖7。

圖6 糖源種類對松乳菇固體培養(yǎng)的影響

圖7 不同糖源對松乳菇菌絲生長的影響

不同種類糖源對松乳菇固體培養(yǎng)的菌絲生長存在顯著影響。從圖6可看出，在以葡萄糖為糖源的培養(yǎng)基中菌落直徑最大，生長速度最快；其次是蔗糖和麥芽糖；菌落直徑最小的糖源為乳糖。從圖7可看出，在葡萄糖為糖源的培養(yǎng)基中菌絲最為濃密、菌絲生長快速呈白色；其次是可溶性淀粉和麥芽糖，菌絲生長較濃密，部分呈黃色；在含蔗糖和乳糖的培養(yǎng)基中菌絲生長稀疏。

李忠海等人[16]對松乳菇固體培養(yǎng)的研究表明，松乳菇菌絲生長的最適培養(yǎng)基是PDA培養(yǎng)，無光照培養(yǎng)。杜麗飛等人[17]對松乳菇菌種分離及菌絲生長特性的研究表明，最適碳源為葡萄糖，最適氮源為乙酸銨，其次是玉米漿和蛋白胨。

2.7 糖源質(zhì)量濃度對松乳菇固體培養(yǎng)的影響

分別用質(zhì)量濃度10，15，20，25，30 g/L替換基本培養(yǎng)基中的葡萄糖，測量菌落直徑。

不同糖源質(zhì)量濃度對松乳菇絲生長的影響見圖8，不同糖源質(zhì)量濃度對松乳菇菌絲生長的影響見圖9。

從圖8可看出，在一定濃度范圍內(nèi)的糖源質(zhì)量濃度對菌絲的生長有促進(jìn)作用，但質(zhì)量濃度過高或過低都會抑制菌絲生長。在質(zhì)量濃度25 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中，菌絲生長速度最快，菌落直徑最大。

從圖9可看出，在糖源質(zhì)量濃度為25 g/L時，菌絲最為濃密，活力旺盛呈白色；其次為20 g/L和15 g/L，菌絲較密，菌落中部呈黃色出現(xiàn)老化現(xiàn)象。

2.8 松乳菇固體培養(yǎng)的生長曲線

圖8 不同糖源質(zhì)量濃度對松乳菇絲生長的影響

圖9 不同糖源質(zhì)量濃度對松乳菇菌絲生長的影響

接種固體種子于優(yōu)化的固體培養(yǎng)基上，每天測量菌落直徑，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、菌落直徑日增長量為縱坐標(biāo)繪制曲線。

松乳菇在最適固體培養(yǎng)條件下的生長曲線見圖10。

圖10 松乳菇在最適固體培養(yǎng)條件下的生長曲線

從松乳菇固體培養(yǎng)的生長曲線可看出，將生長良好菌絲活力旺盛的固體種子接入優(yōu)化的培養(yǎng)基中，首先需要適應(yīng)新生長環(huán)境，菌絲生長緩慢；從6 d開始進(jìn)入快速生長期，這一時期約維持2 d，8 d菌落直徑日增長量達(dá)最大值；之后，菌絲增長速度開始下降，菌絲開始褐化衰老。