鹿茸多肽的制備生理活性及應(yīng)用進(jìn)展

姜 瑋，暢柯飛，張鐵華

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062）

鹿茸是脊索動(dòng)物門、哺乳綱、鹿科動(dòng)物馬鹿和梅花鹿的雄性未骨化密生茸毛的幼角[1]，按動(dòng)物源分為馬鹿茸和花鹿茸。鹿茸是傳統(tǒng)的名貴中藥材，入藥歷史悠久，稱之為“東北三寶”之一。據(jù)中國(guó)藥典記載，鹿茸經(jīng)炮制可為鹿茸片和鹿茸粉，味甘、咸，性溫，歸腎、肝經(jīng)；具有壯腎陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒等功效；主要用于治療腎陽(yáng)不足、精血虧虛、陽(yáng)痿滑精、宮冷不孕、贏瘦、神疲、畏寒、眩暈、耳鳴、耳聾、腰脊冷痛、筋骨痿軟、崩漏帶下、陰疽不斂等[2]。

1 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

我國(guó)對(duì)于鹿茸的精深研究始于20世紀(jì)90年代末期，從之前鹿茸外觀的形態(tài)的研究轉(zhuǎn)入到鹿茸活性成分的制備[3]、鑒定和活性機(jī)理研究[4]，研究水平已處于細(xì)胞和分子生物學(xué)水平。

在CNKI中，以“鹿茸”為主題檢索，文獻(xiàn)截止時(shí)間為2018年12月14日，通過(guò)“指數(shù)”分析的學(xué)科分布顯示，鹿茸在“中藥學(xué)”學(xué)科的比例最高為32.36%，伴隨出現(xiàn)頻率較高的詞分別為鹿茸多肽、化學(xué)成分、藥理作用、含量測(cè)定、多肽。

以“鹿茸”為主題CNKI中檢索，研究的學(xué)科分布示意圖見圖1。

圖1 以“鹿茸”為主題CNKI中檢索，研究的學(xué)科分布示意圖

在web of science中，以“deer antler”為主題檢索，從圖1分析可以看出，國(guó)際對(duì)于鹿茸的研究從1999年開始趨于熱化。

以“deer antler”為主題在web of science中檢索，每年發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)見圖2，以“鹿茸多肽”為主題CNKI中檢索，研究的學(xué)科分布示意圖見圖3。

圖2 以“deer antler”為主題在web of science中檢索，每年發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)

圖3 以“鹿茸多肽”為主題CNKI中檢索，研究的學(xué)科分布示意圖

在CNKI中，以“鹿茸多肽”為主題檢索，文獻(xiàn)截止時(shí)間為2018年12月14日，發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽在“中藥學(xué)”學(xué)科的比例最高為75.85%，伴隨出現(xiàn)頻率較高的詞分別為鹿茸、軟骨細(xì)胞等。在web of science中，以“deer antler和peptide”為主題檢索，總計(jì)檢索到相關(guān)文章278篇，2005年后研究趨于熱化，具體如圖2所示。

以“deer antler”and“peptide”為主題在web of science中檢索，每年發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)見圖4。

圖4 以“deer antler”and“peptide”為主題在web of science中檢索，每年發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)

2 鹿茸多肽的制備

鹿茸多肽是從鹿茸中分離得到的一類分子量在0.2～10 kDa具有生物活性的肽占干鹿茸的50%左右。鹿茸多肽的提取方式較多，有水或乙醇浸提[5]、緩沖溶液浸提、酶解提取等。為保證加工過(guò)程中鹿茸的活性和營(yíng)養(yǎng)的最大保存，研究者采取了很多處理辦法，并申請(qǐng)了專利[6-9]。

2.1 溶劑浸提

鹿茸多肽傳統(tǒng)的獲取方式是煎煮和泡酒，并沿用至今，在日常生活中，很多家庭仍采用這種方式滋補(bǔ)。Jin H等人[10]研究了熱水和超高壓提取鹿茸多肽的方法，以得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，熱水浸提最佳提取溫度90℃，提取時(shí)間20 h，料液比1∶29.34，提取率可達(dá)28.01%（W/W），糖醛酸為3.57 mg/g，葡聚糖為3.27 mg/g，唾液酸0.99 mg/g。超高壓室溫（25℃）提取最佳壓力200 MPa，提取時(shí)間30 min，料液比1∶30，提取率達(dá)4.99%（W/W），糖醛酸為2.37 mg/g，葡聚糖為1.77 mg/g，唾液酸0.74 mg/g。Z G Sui等人[11]采用中性氯化鈉溶液（0.15 mol/L，pH值7.0）、弱酸溶液（0.15 mol/L的乙酸溶液，pH值4.0）、弱堿溶液（0.15 M的甘氨酸——?dú)溲趸c緩沖溶液，pH值10.0）依次提取。董萬(wàn)超等人[12]十二烷基磺酸鈉、巰基乙醇研磨提取，離心取上清液，經(jīng)電泳分離后，多肽的分子量處于17 000～117 500 Da。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)有采用高壓脈沖電場(chǎng)[13]、超高壓[14]、超聲[15]等技術(shù)進(jìn)行輔助提取。

2.2 酶解法提取

徐明等人[16]用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解鹿茸蛋白，以酶解度和多肽得率為指標(biāo)，通過(guò)單酶和雙酶組合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的酶解效果最好，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其組合酶解的最適工藝條件為溫度48℃，pH值7.2，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%，酶與底物濃度比6 000 U/g，2種酶比例為1∶1，酶解時(shí)間4 h，在此條件下酶解度為32.5%，多肽得率為72.8%。王華等人[17]采用堿性蛋白酶Alcalase酶解新鮮成年梅花鹿鹿茸，以對(duì)O2-自由基清除率為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化，最適酶解條件為酶與底物質(zhì)量比1∶150，底物與溶劑質(zhì)量比1∶13，酶解時(shí)間60 min。張龍等人[18]采用堿性蛋白酶Alcalase酶解鮮鹿茸，降解率達(dá)到82%～93%，并就此申請(qǐng)了國(guó)家發(fā)明專利。

3 鹿茸多肽的氨基酸序列

鹿茸多肽與鹿茸的品種、采集部位、加工方式有關(guān)，不同品種的鹿茸成分含量存在差異，且同一品種鹿茸不同部位、不同加工方式的含量和種類也不相同[19]。

董萬(wàn)超等人[12]對(duì)成年梅花鹿茸的化學(xué)成分有較全面的分析，采用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)含有11種游離氨基酸17種以上的酶解氨基酸，并測(cè)出了部分鹿茸多肽的分子量17 000，17 500，18 500，95 500，112 000，117 500 Da。李繼海[20]采用pH值3.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，浸泡梅花鹿茸勻漿過(guò)夜、離心，取上清液、醇沉，獲得粗提物，經(jīng)Sephadex G-50層析和CM-Sepharose Fast Flow柱層析得到一種活性多肽，SDS-PAGE電泳測(cè)得該肽分子量為3 200 Da，蛋白質(zhì)含量達(dá)79.8%，主要含丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸等15種氨基酸。張鄭瑤等人[21]通過(guò)乙醇醇沉、CM-SepharoseFast Flow離子交換層析SephadexG-50凝膠過(guò)濾層析和反相高效液相色譜層析（RP-HPLC）等技術(shù)分離純化得到單體鹿茸多肽，SDS-PAGE電泳顯示一條帶，等電點(diǎn)PI=8.15，激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀確定該單體多肽分子量為3 263.4，由32個(gè)氨基酸殘基組成的直鏈多肽，富含纈氨酸、賴氨酸、亮氨酸和甘氨酸，氨基酸序列為VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM，且顯示與來(lái)源于馬鹿茸的32肽（分子量3 216.0，氨基酸序列為VLSAADKSNVKAAWGKVGGNAPAFGAEALLRM） 具有相似的功能活性，推測(cè)出4個(gè)有差別的氨基酸殘基沒有位于該肽的活性中心。嚴(yán)銘銘等人[22]通過(guò)SephadexG-25層析、DEAE-SepharoseFast Flow離子交換層析和反相C18柱層析，得到主要含纈氨酸、亮氨酸、谷氨酸及脯氨酸的單一鹿茸多肽，氨基酸序列為EPTVLDEVCLAHGP，分子量為1 479.3。

已鑒定的部分鹿茸多肽氨基酸序列見表1。

表1 已鑒定的部分鹿茸多肽氨基酸序列

4 鹿茸多肽的功能活性

4.1 促進(jìn)細(xì)胞增殖作用

翁梁等人[23]利用大鼠建立了皮膚機(jī)械損傷模型，3H-TdR摻入表皮細(xì)胞DNA合成為檢測(cè)手段。體外研究表明，馬鹿茸的總多肽含量為0.8，3.2 mg/g，膏劑外敷能夠加速皮膚修復(fù)，從模型中分離出表皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞；離體試驗(yàn)結(jié)果表明，馬鹿茸總多肽和單體多肽能促進(jìn)表皮細(xì)胞有絲分裂，并推測(cè)修復(fù)的機(jī)理是促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化。牛瓊等人[24]采用肌肉注射、創(chuàng)口外用及二者結(jié)合的方式，考查了鹿茸多肽對(duì)大鼠皮膚機(jī)械損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌肉注射、創(chuàng)口外用二者結(jié)合的方式愈合速度最快、創(chuàng)口細(xì)菌數(shù)最少、創(chuàng)面肉芽組織羥脯氨酸含量最高，與對(duì)照組有顯著差異，創(chuàng)口外用的方式次之。王豐等人[25]通過(guò)陽(yáng)離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、反相高效液相層析分離純化鮮馬鹿茸多肽，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，該肽分子量約為3 500 Da。通過(guò)氨基酸組成分析，該肽主要含纈氨酸、丙氨酸、賴氨酸和甘氨酸，且N-末端氨基酸為纈氨酸，對(duì)大鼠乳鼠表皮細(xì)胞和BRL肝細(xì)胞具有明顯的增殖作用。張鄭瑤等人[21]采用3H-TdR摻入法，研究顯示梅花鹿茸多肽對(duì)原代培養(yǎng)的表皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞具有增殖作用，也能促進(jìn)NIH3T3成纖維細(xì)胞株的分裂。嚴(yán)銘銘等人[22]采用MTT法研究了鹿茸多肽CNT14對(duì)HT22細(xì)胞具有特異性增殖作用，Swillc細(xì)胞（人結(jié)腸癌、乳腺癌細(xì)胞MCF-7）無(wú)增殖作用，從而推測(cè)其對(duì)阿爾茨海默病（老年性癡呆）具有治療作用。陳東等人[26]通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs） 分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽在體外可明顯促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，體現(xiàn)出鹿茸多肽多因素、多因子的協(xié)同作用，且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。

4.2 抗氧化作用

郝林琳等人[27]通過(guò)乙醇沉淀獲取馬鹿茸多肽，在8 mg/kg的腹腔注射劑量下，鹿茸多肽能明顯提高12月齡小鼠的SOD活性、降低MDA的含量，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化作用。王華等人[17]考查了鮮梅花鹿茸多肽（分子量小于800 Da）的抗氧化活性，在質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)對(duì)超氧陰離子的清除率可達(dá)91.9%，質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率達(dá)100%，呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系；能夠阻止脂質(zhì)過(guò)氧化，且具有一定的還原力。

4.3 抗疲勞作用

鹿茸多肽具有抗疲勞作用。郝林琳等人[27]通過(guò)游泳試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高劑量組（8 mg/kg） 比對(duì)照組的游泳時(shí)間延長(zhǎng)了21.67 min。張睿等人[28]研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸多肽能明顯延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、降低小鼠血乳酸和血清尿素氮的含量、提高小鼠體內(nèi)肝糖原和肌糖原的儲(chǔ)備量及運(yùn)動(dòng)后乳酸脫氫酶的活力，具有明顯的抗疲勞作用。X D Luo等人[29]研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸多肽能顯著增加小鼠常壓缺氧存活時(shí)間、斷頭喘氣時(shí)間、爬桿時(shí)間和負(fù)重游泳時(shí)間，并能顯著降低游泳后血清乳酸的增加量。

4.4 免疫調(diào)節(jié)作用

郝林琳等人[27]通過(guò)對(duì)受試小鼠的E玫瑰花環(huán)、溶血素檢測(cè)和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組小鼠的玫瑰花環(huán)成環(huán)率和巨噬細(xì)胞吞噬率顯著高于對(duì)照組，高劑量組的溶血素OD值與對(duì)照組顯著差異，表明鹿茸多肽具有免疫調(diào)節(jié)作用，且具有劑量依賴性。L Zhao等人[30]模擬胃消化系統(tǒng)提取，體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所提取的鹿茸多肽組分對(duì)小鼠脾細(xì)胞具有增殖作用。夏彥玲[31]研究了鹿茸醇提物和鹿茸粉對(duì)小鼠化學(xué)性、藥物性、酒精性及免疫性肝損傷具有顯著保護(hù)作用，且鹿茸醇提物的保肝效果好于鹿茸粉組,并推測(cè)鹿茸醇提物的良好效果是由于含有較多的多肽，這增強(qiáng)了小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能，抑制炎癥反應(yīng),減少肝組織TNF-α和IL等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而對(duì)小鼠肝損傷起到了保護(hù)作用。

4.5 促骨生長(zhǎng)作用

張洪長(zhǎng)等人[32]探討了梅花鹿茸多肽對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs） BMP-2和Runx2表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽可使hBMSCs中的堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，促進(jìn)hBMSCs增殖分化，上調(diào)hBMSCs中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和骨特異性轉(zhuǎn)錄因子2基因和蛋白的表達(dá)，并推測(cè)這可能就是鹿茸多肽對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨形成及骨代謝影響的分子調(diào)控機(jī)制之一。

5 鹿茸多肽的毒理學(xué)評(píng)價(jià)

研究者對(duì)鹿茸多肽進(jìn)行了急性毒性、亞慢性毒性試驗(yàn)、生殖毒性和致突變作用研究。急性毒性顯示鹿茸多肽沒有達(dá)到半數(shù)致死劑量[33]，屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)[34]。亞慢性毒性試驗(yàn)顯示，在正常攝入量的25，50倍時(shí)，受試組的血常規(guī)和血清生化指標(biāo)與正常對(duì)照組差異不顯著；在正常攝入量的100倍時(shí)，受試組的血常規(guī)和血清生化指標(biāo)與正常對(duì)照組差異顯著。

宋述輝等人[35]研究了鹿茸酒（58°酒浸出物∶38°酒=1∶1 000）的小鼠遺傳毒性。研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸酒組與38°酒組的小鼠精子畸變率呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，但二者之間沒有差異，推測(cè)鹿茸無(wú)小鼠精子致畸作用；發(fā)育試驗(yàn)表明，鹿茸酒反而可有效降低38°酒對(duì)胎鼠存活、發(fā)育的影響；繁殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹿茸酒在一定濃度下，可以減少38°酒對(duì)F0，F(xiàn)1小鼠的繁殖能力影響，促進(jìn)F2雄仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。在Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)中均顯示鹿茸水提濃縮液沒有致突變作用[35]。這2個(gè)研究的試驗(yàn)對(duì)象雖為酒、水浸出液，但浸出物中均含有鹿茸多肽。

6 鹿茸多肽的應(yīng)用現(xiàn)狀

6.1 鹿茸多肽在食品行業(yè)的應(yīng)用

目前，市場(chǎng)上關(guān)于鹿茸的產(chǎn)品主要為鹿茸片，屬于初加工產(chǎn)品，主要用于煲湯、泡酒，附加值不高。針對(duì)鹿茸精深加工的產(chǎn)品，也多為粉劑、膠囊、復(fù)合飲料[36]等。以“鹿茸”為發(fā)明名稱檢索，有效的授權(quán)發(fā)明專利79件。以鹿茸為原料研發(fā)產(chǎn)品，有火鍋底料[37]、藥酒[38-46]、保健中藥（制品）[47-48]、鹿茸片[49-51]、餅干[52]、酸奶[53]、果凍[54]、口服液[55-57]等。

已經(jīng)市場(chǎng)化的含有鹿茸多肽的部分產(chǎn)品見表2。

6.2 鹿茸多肽在化妝品行業(yè)的應(yīng)用

鹿茸在化妝品行業(yè)嶄露頭角，已有公司開發(fā)了鹿茸相關(guān)化妝品，如鹿茸養(yǎng)顏寶系列、鹿茸青春寶系列、鹿茸多肽系列，是目前針對(duì)鹿茸開發(fā)的最全的鹿茸化妝品加工公司，并申報(bào)了國(guó)家發(fā)明專利“一種用于皮膚美容保健的復(fù)合鹿茸多肽凍干粉與納米級(jí)緩沖微乳組合精華素及其制備方法”[58]，目前已經(jīng)市場(chǎng)化含鹿茸多肽的化妝品鹿茸多肽緊致霜、鹿茸多肽保濕霜、鹿茸多肽抗皺霜、鹿茸多肽抗皺眼霜、鹿茸活性多肽因子組合(緊致型、提升型、抗皺型)、鹿茸多肽原液（提升型、抗皺型、緊致型） 和鹿茸多肽抗皺眼精華等。

表2 已經(jīng)市場(chǎng)化的含有鹿茸多肽的部分產(chǎn)品

6.3 鹿茸多肽在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用

目前，利用鹿茸的再生能力，已經(jīng)在醫(yī)藥領(lǐng)域展開研究和應(yīng)用，如傷口愈合[59]、抗炎、帕金森病等。新吉樂[60]探討了鹿茸多肽對(duì)1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞急慢性損傷的保護(hù)作用，探討鹿茸多肽對(duì)帕金森病的治療可能性。還有通過(guò)考查脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7 NO的產(chǎn)生，研究了鹿茸多肽的抗炎活性。

7 結(jié)語(yǔ)

鹿茸在臨床上具有悠久的應(yīng)用歷史，近年來(lái)關(guān)于鹿茸的研究也趨于白熱化，尤其是針對(duì)鹿茸多肽，如胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1）等。然而，盡管目前已有很多文獻(xiàn)表明鹿茸極具潛力，無(wú)論在食品、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)，但已市場(chǎng)化的鹿茸產(chǎn)品，尤其是鹿茸精深加工的保健產(chǎn)品仍然較少。究其原因，一是鹿茸開發(fā)的產(chǎn)品形式單一，受眾面較??；二是針對(duì)鹿茸蛋白及多肽的化學(xué)及藥理學(xué)方面的研究往往考查的是混合多肽，是宏觀的表現(xiàn)，沒有更進(jìn)一步考查到底是什么活性肽起了作用，怎么起的作用。因此，運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)分離多肽，尋找出具有代表性的生物活性物質(zhì)，在此基礎(chǔ)上開發(fā)鹿茸功能性產(chǎn)品，具有十分廣闊的前景。