川陳皮素對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細胞凋亡的影響*

石安華，范英昌，姚 政，武俊紫，何朋倫，王 維，周青麗，陳文慧△

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500）

當前隨著我國社會經(jīng)濟的發(fā)展和人們運動量的相對減少，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)生率逐年升高[1]。有研究顯示，在我國NAFLD已經(jīng)成為僅次于病毒性肝炎的第2大疾病[2]。NAFLD臨床中主要表現(xiàn)為肝臟脂肪顆粒的過量聚集，此時需積極控制，如若控制不佳，可造成肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的發(fā)生，而在上述的發(fā)生和進展過程中，肝細胞凋亡伴隨其中[3]。目前西醫(yī)治療本病并沒有特效藥，近年來國內(nèi)外學者采用傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療NAFLD發(fā)現(xiàn)獨特的優(yōu)勢[4]，但是中醫(yī)藥湯劑在治療本病時存在有效藥理成分不明確的問題，因此采用中藥單體治療NAFLD是當前研究的熱點。目前的研究顯示，多種中醫(yī)藥單體在調(diào)節(jié)NAFLD血脂、改善肝功能方面具有獨特的優(yōu)勢，特別是黃酮類化合物[5-6]。川陳皮素（nobiletin）是從中藥陳皮中提取的一類多甲氧基黃酮類化合物，其在抗氧化、改善記憶、抗癌等多種慢性疾病治療方面已有眾多的研究報道[7-8]。但其對 NAFLD的治療作用還缺少相關研究證實，本實驗通過復制NAFLD大鼠模型，探討川陳皮素治療后大鼠肝細胞調(diào)亡相關基因表達特點，以進一步明確川陳皮素治療NAFLD的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、飼料和墊料 健康清潔級SD大鼠72只，6周齡，體質(zhì)量160～180 g，由昆明醫(yī)科大學動物實驗中心提供（動物合格證號為：SYXK（滇）2011-004）。購買后飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學動物實驗部，日常由其自由飲食，室溫為20～24℃，光照/黑暗=12 h/12 h，普通飼料、飼養(yǎng)用墊料均由昆明醫(yī)科大學提供；高脂飼料由本課題組提供配方（普通飼料加10%豬油，2%膽固醇），交由昆明醫(yī)科大學動物實驗中心配置。

1.2 實驗材料和儀器 川陳皮素購于酷爾化學科技（北京）有限公司；水飛薊素膠囊購于天津天士力圣特制藥有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒購于武漢默沙克生物科技有限公司、白介素-1a（Interleukin-1a，IL-1a）、 白 介 素 -1b（Interleukin-1b，IL-1b）和白介素 -6（Interleukin-6，IL-6）試劑盒購于武漢博士德生物有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、腫瘤壞死因子受體 1（Tu mor necrosis factor receptor 1，TNFR-1）、跨膜糖蛋白（Fas）、跨膜糖蛋白配體（FasL）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（Caspase-8）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、B-細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（Bcl-2）、Bcl-2相關基因（Bax）蛋白以及 β-actin抗體購于美國Santa公司；

酶標儀（HBS-1096A型，南京德鐵實驗設備有限公司）；全自動生化分析儀（CHEMIX-180型，日本SYSMEX公司）；精密電子天平（AB135-S型，上海精密儀器儀表有限公司）；蛋白電泳儀（Mini Gel型，賽默飛世爾中國有限公司）；PCR儀（ProFlex型，賽默飛世爾中國有限公司）。

1.3 動物分組、造模和給藥劑量 所有大鼠在購買后均給予適應性喂養(yǎng)2周，2周后采用隨機數(shù)字法將大鼠分為6組，分別為正常組、模型組、陽性藥物水飛薊素治療組、川陳皮素低、中、高劑量組，每組12只。除正常組外，其余5組給予高脂飲食8周，構建NAFLD模型（模型構建成功的標準為每組各處死2只大鼠，血清肝功能指標檢測和肝臟切片病理學觀察，有明顯脂肪肝表征時證明造模成功）。

造模成功后，給予相應治療，其中正常組和模型組給予每日10 mL/kg生理鹽水灌胃，水飛薊素組以水飛薊素14 mg/kg灌胃治療，川陳皮素低、中、高劑量組給予川陳皮素100、200、400 mg/kg灌胃治療，水飛薊素給藥劑量根據(jù)大鼠和人體換算公式計算得到，川陳皮素給藥劑量根據(jù)文獻報道[9]確定，每天給藥1次，連續(xù)給藥6周。

1.4 肝臟和血液收集 于前夜禁食不禁水12 h后，次日稱重后處死大鼠，處死時采用3 mL的1%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后固定于解剖板，心臟取血法收集大鼠血液，血液收集后分裝于1.5 mL的離心管中，離心后提取上清液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ笃书_腹腔，取出肝臟，采血后即刻脫頸處死大鼠，作腹部正中切口打開腹腔，取出完整肝臟，稱重后，切取肝左葉置于4%的中性福爾馬林溶液中保存?zhèn)溆糜贖E染色，其它組織切成4小塊分裝于凍存管中置于超低溫冰箱中備用于蛋白和mRNA的檢測。

1.5 一般情況、肝指數(shù)及相關生化指標檢測 大鼠一般情況要求每天記錄，主要觀察大鼠毛色、體重生長情況、飲食、大小便以及死亡情況。大鼠肝指數(shù)為肝臟重量 /大鼠體重×100%。ALT、AST、HDL-C、LDL-C、TC和TG根據(jù)試劑盒說明書采用全自動生化儀檢測。IL-1a、IL-1b和IL-6嚴格按照試劑盒說明書操作，采用酶標儀檢測。

1.6 組織病理學檢測 從中性福爾馬林溶液中取出肝組織，進行常規(guī)石蠟包埋和切片，切片后，采用二甲苯脫蠟、梯度酒精清洗、超純水清洗、蘇木紫染色、清洗后伊紅染色、二甲苯透明封片。制片成功后光鏡下觀察收集圖像。

1.7 凋亡相關蛋白檢測 稱取1g肝臟組織，用組織蛋白裂解液裂解后提取上清，BCA法定量后調(diào)平，每組各取50 μg行SDS-PAGE電泳，電泳完成后將目的條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜，之后依次按照5%脫脂奶粉封閉2 h后PBST洗滌3次、加入一抗過夜后洗滌3 次[TNF-α（1 ∶5 000）、TNFR-1（1 ∶5 000）、Fas（1 ∶3 000）、FasL（1 ∶1 000）、Caspase-8（1 ∶2 000）、Caspase-3（1 ∶2 000）、Bcl-2（1 ∶5 000）和 Bax（1 ∶5 000）]、加入二抗（1∶5 000）2 h 后洗滌 3 次，暗室曝光、顯影定影后掃描儀收集圖片，Image J計算每個條帶的灰度值，每組實驗重復3次。

1.8 凋亡相關蛋白mRNA檢測 稱取100 mg肝臟組織，采用總RNA試劑盒提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳確認成功提取后，定量并調(diào)平，每組各取2 μg將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，之后即進行qRT-PCR電泳，電泳條件為擴增95℃預變性2 min；95℃變性10 s，退火60℃、30 s，72℃延伸35 s，循環(huán)次數(shù)35次。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列設計為表1所示。

表1 引物序列設計表

2 結果

2.1 大鼠一般情況 正常組大鼠精神活躍，毛色發(fā)亮，飲食和生長均正常；相較于正常組，模型組在造模成功后體重明顯增加，小便量增加，大便油膩發(fā)臭，毛色發(fā)黃，飲食量相較于正常組有一定的降低，藥物治療后，模型組體重增加幅度降低；水飛薊素片治療組以及川陳皮素低、中、高劑量組相較于模型組上述表現(xiàn)改善，特別是活動量有明顯增加。

2.2 大鼠肝臟病理學 光鏡下，正常組大鼠肝細胞大小均一，肝小葉結構正常，看不到任何脂肪變性以及炎細胞浸潤，模型組則出現(xiàn)明顯的肝細胞損傷，主要表現(xiàn)為肝細胞可見大量脂肪空泡，嚴重者空泡融合，將胞核擠向一側，同時也可見肝細胞胞漿疏松化、氣球樣變，炎細胞浸潤。相較于模型組，水飛薊素片以及川陳皮素低、中、高劑量組肝臟上述病變明顯減輕。

圖1 大鼠肝臟HE染色鏡下觀（20×20）

2.3 大鼠肝指數(shù) 與正常組相比，模型組大鼠肝濕重和肝指數(shù)明顯升高（P<0.05）；相較于模型組，水飛薊素片治療組以及川陳皮素低、中、高劑量組肝濕重和肝指數(shù)明顯降低（P<0.05）；此外川陳皮素高劑量組肝指數(shù)明顯低于水飛薊素片治療組（P<0.05）；而體重各組間則沒有明顯差異，詳見表2。

表2 治療前后各組大鼠肝重、體重和肝指數(shù)的變化（±s,n=12）

表2 治療前后各組大鼠肝重、體重和肝指數(shù)的變化（±s,n=12）

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與水飛薊素片組相比，△P<0.05

組別 肝濕重/g 體重/g 肝重/體重/%正常組 13.01±1.08 462.87±32.34 2.81±0.28模型組 19.54±2.45*474.71±40.48 4.12±0.60*水飛薊素片組 15.77±1.89*#464.52±37.69 3.39±0.57*#川陳皮素低劑量組 17.04±1.43*#473.62±32.65 3.60±0.41*#川陳皮素中劑量組 16.38±1.36#468.37±31.61 3.50±0.25*#川陳皮素高劑量組 14.65±1.17*#476.54±29.85 3.07±0.32*#△

2.4 大鼠肝功能 與正常組相比，模型組大鼠血清肝功能指標ALT和AST明顯增高（P<0.05）；與模型組相比，水飛薊素片治療組以及川陳皮素低、中、高劑量組則明顯降低（P<0.05），此外，川陳皮素高劑量組ALT和AST均低于水飛薊素片治療組（P<0.05），詳見表3。

表3 治療前后大鼠血清肝功能指標ALT和 AST 的變化（±s，n=12,U/L）

表3 治療前后大鼠血清肝功能指標ALT和 AST 的變化（±s，n=12,U/L）

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與水飛薊素片組相比，△P<0.05

組別 AST ALT正常組 36.54±3.15 39.76±2.28模型組 72.33±6.21* 77.79±8.04*水飛薊素片組 49.25±5.72*# 50.54±4.71*#川陳皮素低劑量組 52.19±4.68*# 53.65±5.02*#川陳皮素中劑量組 48.72±4.83*# 52.36±4.82*#川陳皮素高劑量組 43.71±3.27*#△ 45.12±3.24*#△

2.5 大鼠血脂 與正常組相比，模型組大鼠血清血脂指標TG、TC和LDL-C含量明顯升高（P<0.05），HDL-C明顯降低（P<0.05）；與模型組相比，水飛薊素片治療組以及川陳皮素低、中、高劑量組TG、TC和LDL-C含量均明顯降低（P<0.05），HDL-C明顯升高（P<0.05）；此外，川陳皮素中劑量和高劑量組TG、TC和LDL-C明顯低于水飛薊素片治療組（P<0.05），HDL-C明顯高于水飛薊素片治療組（P<0.05），詳見表4。

表4 治療前后各組大鼠血脂指標的變化（±s，n=12，mmol/L）

表4 治療前后各組大鼠血脂指標的變化（±s，n=12，mmol/L）

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與水飛薊素片組相比，△P<0.05

LDL-C.14±0.02 52±0.11*27±0.08*#32±0.05*#1±0.06*#△0±0.02*#△

2.6 大鼠炎性因子 與正常組相比，模型組大鼠血清炎性因子指標IL-1a、IL-1b和IL-6明顯增高（P<0.05）；與模型組相比，水飛薊素片治療組以及川陳皮素低、中、高劑量組IL-1a、IL-1b和IL-6均明顯降低（P<0.05）。此外，川陳皮素高劑量組上述3個指標均明顯低于水飛薊素片治療組（P<0.05），詳見表5。

表5 治療前后大鼠炎性因子IL-1和Il-6的變化（±s，n=12）

表5 治療前后大鼠炎性因子IL-1和Il-6的變化（±s，n=12）

注；與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與水飛薊素片組相比，△P<0.05

IL-6/（μg·L-1）正常組 6.04±0.21 6.87±0.28 16.77±1.92組別 IL-1a/（mmol·L-1）IL-1b/（mmol·L-1）模型組 14.33±1.25*17.50±1.36* 28.54±2.74*水飛薊素片組 8.76±0.78*# 10.65±0.67*#19.35±1.69*#川陳皮素低劑量組 8.97±0.49*# 10.14±0.80*#21.44±1.73*#川陳皮素中劑量組 8.24±0.59*# 9.92±0.59*# 20.82±1.52*#川陳皮素高劑量組 7.12±0.52*#△ 8.65±0.47*#△ 17.26±1.45#△

2.7 大鼠凋亡相關蛋白的表達特點 大鼠凋亡相關蛋 白 TNF-α、TNFR-1、FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax和Bcl-2表達特點如圖2和圖3所示。從圖中可以明顯看出，與正常組相比，模型組TNF-α、TNFR-1、FasL、Fas、Caspase-8 和 Caspase-3 明顯升高（P<0.05），Bcl-2表達明顯降低（P<0.05）；與模型組相比，水飛薊素片治療組、川陳皮素低、中、高劑量組TNF-α、TNFR-1、FasL、Fas、Caspase-8 和 Caspase-3明顯降低（P<0.05），Bcl-2表達明顯升高（P<0.05）；與正常組相比，模型組Bax表達明顯升高（P<0.05），與模型組相比，水飛薊素片治療組沒有變化，但川陳皮素三個治療組降低（P<0.05）；此外，川陳皮素低、中、高劑量組 TNF-α、TNFR-1、FasL 和 Caspase-8 明顯低于水飛薊素片治療組（P<0.05），川陳皮素中、高劑量組Fas和Bax明顯低于水飛薊素片治療組（P<0.05），川陳皮素高劑量組Caspase-3明顯低于水飛薊素片治療組（P<0.05）、Bcl-2明顯高于水飛薊素片治療組。

圖2 大鼠凋亡相關蛋白的表達圖

圖3 大鼠凋亡相關蛋白相對表達量

2.8 大鼠凋亡相關蛋白mRNA的表達特點 大鼠凋 亡 相 關 蛋 白 TNF-α、TNFR-1、FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA 表達特點如圖4所示。從圖中可以明顯看出，與正常組相比，模型組TNF-α、TNFR-1、FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3 和Bax明顯升高（P<0.05），Bcl-2表達明顯降低（P<0.05）；與模型組相比，水飛薊素片治療組、川陳皮素低、中、高劑量組 TNF-α、TNFR-1、FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3和 Bax明顯降低（P<0.05），Bcl-2表達明顯升高（P<0.05）。此外，川陳皮素低、中、高劑量組TNF-α、Caspase-8和Bax明顯低于水飛薊素片治療組（P<0.05），川陳皮素中和高劑量組TNFR-1、FasL、Fas明顯低于水飛薊素片治療組（P<0.05），川陳皮素低、中、高劑量組Bcl-2明顯高于水飛薊素片治療組（P<0.05）。

3 討論

NAFLD發(fā)病機制較為復雜，其涉及到脂代謝、二次打擊、氧化損傷等多種復雜的代謝過程[10]，因此構建一個好的NAFLD動物模型，使其更貼切于人類NAFLD發(fā)病機制是實驗成功的保障。目前醫(yī)學界用來構建NAFLD的動物模型主要有2種方式，第1種為基因改良模型[11-12]，此模型目前應用較多的為CD36基因敲除模型和乙酰輔酶A氧化酶基因缺乏模型，二者根據(jù)藥物的作用機理不同，而各有側重。CD36基因敲除鼠模型可以表現(xiàn)有明顯的脂肪肝特征，也會造成總膽固醇的升高和胰島素抵抗的發(fā)生，但其側重點為氧化應激和肝細胞凋亡方面。乙酰輔酶A氧化酶基因缺乏小鼠則主要表現(xiàn)為脂代謝異常引發(fā)的NAFLD，其適用于肝臟降脂藥物的基礎實驗研究。但不管是CD36基因敲除模型還是乙酰輔酶A氧化酶基因缺乏模型，二者造價均較為昂貴，因此不被廣泛推廣。第2種模型即為高脂高糖誘導模型[13]，本類方法簡單易行，同時造價相對低廉，構建的模型較為穩(wěn)定，因此推廣性較高。本次研究即采用高脂誘導脂肪肝模型，從HE染色可以明顯看出，模型組大鼠鏡下可見肝細胞脂肪變性、胞漿疏松化、氣球樣變、炎細胞浸潤等NAFLD的病理特征，這證明所構建的模型是成功的，可以用于后續(xù)的研究開展。

NAFLD發(fā)生后，大鼠最典型的特點為肝臟病理學的損傷，同時出現(xiàn)明顯的肝功能和血脂異常[14]。陳皮素被發(fā)現(xiàn)有多種生物活性，其在抗癌、消炎、抗氧化以及調(diào)節(jié)血管平滑肌等多個方面均表現(xiàn)有較好的藥理活性。目前也有研究采用川陳皮素治療NAFLD，但是上述的研究僅限于細胞學的研究，動物學的研究還缺少文獻證實，相關的作用機理也沒有明確[15-16]。本次研究采用川陳皮素治療NAFLD大鼠，研究結果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，川陳皮素低、中、高劑量組均可以明顯的降低NAFLD大鼠肝功能指標AST和ALT，同時也可以明顯的調(diào)節(jié)血脂，降低肝臟指數(shù)。肝臟病理學結果也顯示，在治療后，川陳皮素3個劑量組脂肪空泡數(shù)量均明顯降低，炎細胞浸潤有明顯改善，這種治療效果與臨床中常用的保肝護肝藥物水飛薊素片相一致，這提示川陳皮素可治療NAFLD，那么其作用機理是什么？

細胞凋亡是機體維持自身穩(wěn)定的一種基本的生理活動現(xiàn)象，但是細胞凋亡過低和過高均可以導致疾病的發(fā)生[17]。目前關于細胞凋亡在非酒精性脂肪性肝病中的作用和發(fā)生機制以及相關的藥物治療已有大量的文獻報道。而鑒于川陳皮素在抗凋亡和抗炎方面的作用，因此推測川陳皮素實現(xiàn)保肝護肝作用可能是通過調(diào)節(jié)細胞凋亡實現(xiàn)的。目前介導NAFLD肝細胞凋亡常見的信號通路主要3條[18-21]，分別為死亡受體通路、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。死亡受體通路包括TNF家族的Fasl/Fas和TNF-α/TNFR-1等介導的調(diào)亡信號通路，本類通路可以直接調(diào)控炎癥的發(fā)生。線粒體通路主要是指Bcl-2蛋白家族相關的基因，其中典型的蛋白為Bax和Bcl-2，二者可形成同源二聚體，以起到對細胞凋亡的抑制或促進作用。第3條通路為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路與凋亡相關的代表性蛋白主要為Caspase家族蛋白，其可以參與膽固醇的合成和脂質(zhì)的代謝。本次研究觀察川陳皮素治療前后肝臟組織中上述3條通路的代表性蛋白TNF-α、TNFR-1、FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax、Bcl-2 的表達特點，研究結果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，川陳皮素低、中、高劑量組 TNF-α、TNFR-1、FasL、Fas 、Caspase-8、Caspase-3和Bax明顯降低，而Bcl-2表達明顯升高。這提示，川陳皮素具有明顯的調(diào)節(jié)NAFLD大鼠凋亡發(fā)生的作用。

綜上所述，本次研究證實川陳皮素對高脂飲食誘導的NAFLD大鼠肝功能、血脂以及肝臟病理學有著明顯的改善作用，其治療NAFLD的作用可能是通過抑制細胞凋亡，降低炎癥反應實現(xiàn)的。