基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的六味地黃丸治療冠心病的分子機(jī)制研究*

楊志華，劉 琰，閆海峰，姬艷蘇，王淑萍△

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.武警特色醫(yī)學(xué)中心，天津 300162)

冠心病是我國(guó)最常見的心血管疾病之一，歸屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”的范疇，臨床多以胸背痛、胸中窒悶、心悸、氣短為主要表現(xiàn)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)冠心病人數(shù)高達(dá)1 100萬(wàn)，且死亡率呈上升趨勢(shì)[1]。本病的發(fā)生多與外感寒邪、飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞倦內(nèi)傷、年老體虛等因素有關(guān)[2]，好發(fā)于40歲以上的中老年人[3]，《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》中記載：“年四十，而陰氣自半也，起居衰矣?！比酥林心辏I氣自半、精血漸衰、腎陰虧虛，不能濡養(yǎng)五臟之陰，心脈失于濡養(yǎng)而發(fā)為胸痹，腎陰虛是冠心病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)[4]。

六味地黃丸原名“地黃丸”，被譽(yù)為“補(bǔ)陰方藥之祖”，首載于宋·錢乙《小兒藥證直決》，系錢乙從《金匱要略》的腎氣丸中減去桂枝、附子而成，由熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、澤瀉、茯苓6味藥物組成，具有填精滋陰補(bǔ)腎之功效，主治腎陰不足證[5]。有醫(yī)家從腎論治冠心病，運(yùn)用六味地黃丸加減治療冠心病取得很好的臨床療效[6-9]。由于中藥及其復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)，這種復(fù)雜性使其作用機(jī)制不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是指將藥物作用網(wǎng)絡(luò)與生物網(wǎng)絡(luò)整合在一起，分析藥物在此網(wǎng)絡(luò)中與特定節(jié)點(diǎn)或模塊的相互作用關(guān)系，從而理解藥物和機(jī)體相互作用的科學(xué)[10]，從整體觀角度認(rèn)識(shí)藥物與疾病間的相互作用[11]。本文通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討六味地黃丸治療冠心病的藥物成分及可能的分子作用途徑，通過(guò)建立“藥物成分-靶點(diǎn)-通路”之間的關(guān)系，分析該方治療冠心病的作用機(jī)制，以期為冠心病相關(guān)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究及六味地黃丸的臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 六味地黃丸活性成分的篩選 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）篩選六味地黃丸全方中熟地黃、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、牡丹皮的所有化學(xué)成分，建立六味地黃丸全方中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。藥物在人體內(nèi)要經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝和排泄（ADME）過(guò)程才能到達(dá)靶器官發(fā)揮其治療作用，基于口服生物利用度（oralbioavailability，OB）、類藥性（Drug-likeness，DL）是篩選藥物的關(guān)鍵參數(shù)，以ADME參數(shù)中的OB≥30%、類藥性DL≥0.18[13-14]為限制條件進(jìn)行初步篩選，匯總結(jié)果、去除重復(fù)、刪除沒(méi)有相關(guān)信息的化學(xué)成分，即為六味地黃丸治療冠心病相關(guān)的生物活性成分。

1.2 六味地黃丸活性成分的潛在靶蛋白的收集及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)已篩選的六味地黃丸全方中藥活性成分，通過(guò)TCMSP平臺(tái)檢索與候選化合物相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，并通過(guò) Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org/）將預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名。將篩選的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.2.1軟件，構(gòu)建6味中藥及其化學(xué)成分、潛在靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)可視化圖。

1.3 冠心病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 利用TTD、Drugbank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，數(shù)據(jù)庫(kù)以“coronary heart disease”為檢索詞，收集與冠心病相關(guān)的靶點(diǎn)，并刪除假陽(yáng)性和重復(fù)基因，最終確定冠心病相關(guān)靶基因。

1.4 構(gòu)建六味地黃丸治療冠心病的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖 采用Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建六味地黃丸治療冠心病的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖。將篩選的六味地黃丸的活性成分及其靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件，構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。為明確六味地黃丸潛在靶點(diǎn)與冠心病相關(guān)靶點(diǎn)之間的相互作用，將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，篩選出六味地黃丸與冠心病的共同靶點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape3.2.1建立冠心病相關(guān)性的“化合物-靶點(diǎn)-冠心病”網(wǎng)絡(luò)。其中的節(jié)點(diǎn)（node）代表化合物、靶蛋白或疾病，邊（edge）代表這些節(jié)點(diǎn)之間的互作關(guān)系，即某個(gè)成分與靶點(diǎn)或靶點(diǎn)與疾病之間的聯(lián)系。

1.5 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選到“疾病-藥物成分”共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，將物種設(shè)置為“Homo sapiens”，為確保數(shù)據(jù)的可靠性，蛋白最低相互作用閾值設(shè)為“highest confidence”（＞0.9），對(duì)蛋白相互作用進(jìn)行篩選，將結(jié)果保存成TSV格式，保留文件中node1、node2和Combined score數(shù)據(jù)并導(dǎo)入Cytoscap3.2.1軟件，分析蛋白相互作用網(wǎng)路。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp，Version 6.8）[12]是支持大規(guī)模的基因/靶蛋白列表分析的穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，能夠找出最顯著富集的生物學(xué)注釋，被用來(lái)進(jìn)行GO生物過(guò)程富集分析和KEGG代謝通路富集分析，以進(jìn)一步研究六味地黃丸治療冠心病靶蛋白群的協(xié)同作用情況。將藥物與冠心病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，設(shè)定閾值P＜0.05，篩選排名靠前的生物過(guò)程或通路。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸的活性成分篩選與ADME分析 本研究通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)六味地黃丸6味中藥已報(bào)道的化學(xué)成分進(jìn)行檢索，共收集以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為參數(shù)進(jìn)行初步篩選，結(jié)果為熟地黃2個(gè)，山茱萸20個(gè)，山藥16個(gè)，茯苓15個(gè)，澤瀉10個(gè)，牡丹皮11個(gè)，刪除重復(fù)成分5個(gè)，剔除沒(méi)有相關(guān)信息成分26個(gè)，共有43個(gè)入血活性成分有良好的口服生物利用度和類藥性，見表1。將藥物成分及作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件進(jìn)行可視化分析，見圖1。共包括6味中藥，43種化學(xué)成分，208個(gè)潛在靶點(diǎn)。橢圓節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，三角形節(jié)點(diǎn)代表化學(xué)成分，八邊形節(jié)點(diǎn)代表中藥。水綠色、紅色、淺藍(lán)色、黃色、綠色、紫色三角形節(jié)點(diǎn)分別代表熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、茯苓、牡丹皮的化學(xué)成分。Sitosterol（谷甾醇）是熟地黃、山茱萸、牡丹皮、澤瀉4味中藥共有的化學(xué)成分，stigmasterol（豆甾醇）是熟地黃、山茱萸、山藥3味中藥共有的化學(xué)成分。

圖1 六味地黃丸-化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

表1 六味地黃丸活性化合物信息

2.2 六味地黃丸中藥與冠心病相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)TTD、Drugbank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，獲得冠心病相關(guān)的靶點(diǎn)996個(gè)。將996個(gè)疾病靶點(diǎn)與208個(gè)藥物成分靶點(diǎn)輸入Venny 2.1軟件繪制韋，得到二者共同靶點(diǎn)85個(gè)，A代表冠心病靶點(diǎn)，B代表六味地黃丸潛在靶點(diǎn)，見圖2。通過(guò)Cytoscape3.2.1軟件建立中藥-靶點(diǎn)-疾病（traditional Chinese medicine-Target-Disease，C-T-D）網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，共包括6味中藥，1種疾病，85個(gè)靶點(diǎn)，最外層藍(lán)色橢圓形節(jié)點(diǎn)代表共同靶點(diǎn)。將85個(gè)共同靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)，分析PPI網(wǎng)絡(luò)9（圖4）。該網(wǎng)絡(luò)由75個(gè)節(jié)點(diǎn)（10個(gè)節(jié)點(diǎn)未在網(wǎng)絡(luò)中）、195條邊組成。其中，節(jié)點(diǎn)的大小由自由度決定，自由度越大，節(jié)點(diǎn)越大。圖中節(jié)點(diǎn)顏色根據(jù)自由度進(jìn)行設(shè)定，顏色從綠色逐漸到紅色的改變自由度逐漸增大，同一類的節(jié)點(diǎn)顏色相近；邊的粗細(xì)由介數(shù)決定，介數(shù)越大，邊越粗。其中腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF，度=22）、蘇氨酸蛋白激酶（threonine-protein kinase，AKT1，度=16）、白細(xì)胞介素 6（Interleukin-6，IL6，度=15）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA，度=14）、（Retinoic acid receptor RXR-alpha，RXRA，度=12）、白細(xì)胞介素 8（In－terleukin-8，CXCL8，度=12）、細(xì)胞腫瘤抗原 p53（Cellular tumor antigen p53，TP53，度=12）、原癌基因 c-Fos（Proto-oncogene c-Fos，F(xiàn)OS，度=12）等靶蛋白度值大，與其他靶蛋白相互作用強(qiáng)，在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。由此推測(cè)，這些蛋白可能是六味地黃丸治療冠心病的關(guān)鍵靶蛋白。

圖2 冠心病靶點(diǎn)與六味地黃丸靶點(diǎn)Venn圖

圖3 六味地黃丸與冠心病共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.3 GO生物學(xué)過(guò)程富集分析 對(duì)六味地黃丸治療冠心病的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程分析，取P值最小的前20個(gè)生物學(xué)過(guò)程，見表2。GO生物學(xué)過(guò)程富集分析結(jié)果提示，39個(gè)靶點(diǎn)參與細(xì)胞組分（45.9%），13個(gè)靶點(diǎn)參與了信號(hào)通路傳導(dǎo)（15.3%），8個(gè)參與了炎癥反應(yīng)（9.4%），13個(gè)靶點(diǎn)參與了RNA聚合酶II啟動(dòng)子調(diào)控（15.3%），6個(gè)靶點(diǎn)參與了調(diào)控血管生成（7.1%），12個(gè)靶點(diǎn)參與了DNA復(fù)制（14.1%），10個(gè)靶點(diǎn)參與了DNA轉(zhuǎn)錄（11.8%）等。由此可知，六味地黃丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程治療冠心病。

表2 GO功能富集分析

2.4 六味地黃丸KEGG代謝通路富集分析 利用David平臺(tái)對(duì)篩選出的核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得90條富集結(jié)果，其中P＜0.01，與冠心病密切相關(guān)的前20條信號(hào)通路包括癌癥通路、腫瘤壞死因子（TNF）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）、雌激素（Estrogen）、toll樣受體（TLRs）、磷脂酰肌醇 3-激酶-蛋白激酶（PI3K/Akt）、核因子（NF-κB）、環(huán)鳥苷酸依賴的蛋白激酶（cGMP-PKG）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路，見表3。這提示六味地黃丸通過(guò)作用于多條信號(hào)通路、多靶點(diǎn)來(lái)治療冠心病，且這些通路之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系。

表3 靶點(diǎn)通路富集結(jié)果

3 討論

冠心病是冠狀動(dòng)脈由于各種原因發(fā)生粥樣硬化，導(dǎo)致血管狹窄或閉塞，使心肌缺血缺氧或壞死引起的心臟病，也稱缺血性心臟病。其主要危險(xiǎn)因素包括高血壓、血脂異常、糖尿病、肥胖和超重、吸煙、遺傳因素等[3]，近10余年我國(guó)冠心病發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[15]。六味地黃丸是中醫(yī)臨床治療冠心病的經(jīng)典方，現(xiàn)代藥理研究表明，熟地黃[16]、山藥[17]具有抗氧化作用，澤瀉具有降血壓、降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮的功能[18]，牡丹皮可以降血糖[19]、保護(hù)心血管[20-21]，山茱萸具有降血糖、降血脂的作用[22]，茯苓具有抗炎作用[23]。雖然對(duì)六味地黃丸6味中藥主要成分的藥理學(xué)作用已基本明確，但作為復(fù)方研究其治療冠心病的潛在靶點(diǎn)和可能作用機(jī)制卻鮮見報(bào)道。

本研究經(jīng)過(guò)初步篩選得到74個(gè)六味地黃丸的生物活性成分，剔除重復(fù)和沒(méi)有相關(guān)信息的成分后最終獲得43個(gè)生物活性成分，對(duì)應(yīng)成分靶點(diǎn)208個(gè)，冠心病靶點(diǎn)996個(gè)，二者共同靶點(diǎn)85個(gè)。通過(guò)對(duì)85個(gè)靶蛋白進(jìn)行 PPI 分析發(fā)現(xiàn)，TNF、AKT1、IL6、VEGFA、RXRA、CXCL8、TP53、FOS 等靶蛋白度值大，說(shuō)明這些靶蛋白在六味地黃丸治療冠心病過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，揭示了六味地黃丸可能通過(guò)抗炎、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮等多途徑來(lái)治療冠心病。

GO富集分析結(jié)果顯示，六味地黃丸治療冠心病主要涉及細(xì)胞分裂、氧化應(yīng)激、物質(zhì)代謝、DNA復(fù)制及其轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過(guò)程，蛋白、受體、轉(zhuǎn)錄因子、激素、信號(hào)分子等多種物質(zhì)參與，說(shuō)明六味地黃丸治療冠心病是一個(gè)十分復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，六味地黃丸治療冠心病相關(guān)的信號(hào)通路包括TNF、HIF-1、PI3K/Akt、Estrogen、TLRs、NF-κB、cGMP-PKG、cAMP、VEGF等。冠心病是一種復(fù)雜的慢性炎癥性疾病，相關(guān)研究表明，炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)在冠心病的發(fā)生、發(fā)展及其預(yù)后過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用[24]。TNF-α是人體內(nèi)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液免疫的主要細(xì)胞因子，其血清水平可以反應(yīng)機(jī)體炎癥反應(yīng)狀況，TNF-α與冠心病密切相關(guān)[25]，并且血清TNF-α水平與冠心病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[26]。缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）是低氧狀態(tài)下組織細(xì)胞產(chǎn)生的一種核蛋白，用于維持氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵物質(zhì)[27]，當(dāng)心肌缺血缺氧時(shí)HIF-1α表達(dá)增加，促進(jìn)血管新生，增加心肌血供，對(duì)保護(hù)心肌具有重要意義[28]。PI3K/Akt信號(hào)通路具有廣泛的生物學(xué)作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、能量代謝、物質(zhì)合成等途徑，是治療冠心病、代謝紊亂等多種疾病的重要靶點(diǎn)[29]。此外，PI3K/Akt信號(hào)通路可通過(guò)抑制糖原合酶激酶-3（glycogen synthase，GSK-3）的活性，增加心肌對(duì)葡萄糖的攝取和脂代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)保護(hù)心臟的作用[30]，韓軍等[31]通過(guò)激活 PI3K/Akt信號(hào)通路，降低IL-6、TNF-α的活性，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)心肌。Estrogen可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制炎癥反應(yīng)、減輕心肌缺血損傷及保護(hù)血管內(nèi)膜等方面預(yù)防冠心病[32]，雌激素水平降低，心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)在絕經(jīng)后顯著增加[33]。TLRs是一種Ⅰ型跨膜蛋白受體，能夠介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)，其介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、調(diào)控免疫反應(yīng)、參與細(xì)胞凋亡、斑塊穩(wěn)定性及血管重塑等動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程，與冠心病有密切的關(guān)系[34]。核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路與冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)[35]，其在調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，曹選超等[36]發(fā)現(xiàn)NF-κB高表達(dá)的患者可能存在嚴(yán)重的冠脈狹窄，NF-κB信號(hào)通路經(jīng)多種刺激因子誘導(dǎo)后，在下游調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素相關(guān)基因，凋亡抑制因子等多種基因的表達(dá)，不僅參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及腫瘤等生理病理過(guò)程，還參與感染、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化及凋亡等[34]?，F(xiàn)有的研究結(jié)果證明，cGMP-PKG信號(hào)通路對(duì)于調(diào)控心血管系統(tǒng)的正常功能起著重要的作用，其在調(diào)節(jié)血壓、抑制動(dòng)脈粥樣硬化和抗再狹窄、抗血管損傷、調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的收縮和舒張、抑制心肌細(xì)胞肥大等方面發(fā)揮重要作用[37-38]。cAMP是傳遞生命信息的重要物質(zhì)，與心肌細(xì)胞的抗缺血、抗氧化及抗損傷能力密切相關(guān)，其可增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮力，增加心輸出量，在一定程度上減輕了心肌缺血[39]。KEGG通路富集結(jié)果提示，六味地黃丸可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抗心肌缺血、保護(hù)血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)脂代謝等途徑治療冠心病。

綜上所述，本研究通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，將網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)、藥理學(xué)等多學(xué)科相結(jié)合，從系統(tǒng)生物學(xué)角度揭示六味地黃丸的中藥藥理作用，從多角度探索了六味地黃丸治療冠心病的可能作用機(jī)制，預(yù)測(cè)了六味地黃丸治療冠心病的潛在靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為其臨床應(yīng)用及進(jìn)一步驗(yàn)證其藥理作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。