基于生信分析預(yù)測人參-茯苓藥對治療結(jié)直腸癌的分子機制*

周小英，苗大興，符中柱，龔超超，袁盛蘭，熊 浩

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）在全球范圍內(nèi)是發(fā)病率排名第3的癌癥，也是全球第2的死亡原因，其中亞洲的死亡率最高，達52.4%[1]。目前CRC的發(fā)病率仍處于上升趨勢，過去幾十年中發(fā)病率增加了2倍[2]。目前結(jié)直腸癌的治療主要為手術(shù)治療、放化療及靶向治療，但不可避免的存在治療費用昂貴、副作用大的弊端[3]。祖國醫(yī)學(xué)對結(jié)直腸癌研究歷史悠久，屬中醫(yī)“鎖肛痔”“積聚”“臟毒”“腸蕈”等范疇。在控制疾病的進展，延長患者生存時間，減少不良反應(yīng)和改善生活質(zhì)量等有著重要的作用[4]。

人參-茯苓藥對來源于四君子湯，為貴州省名中醫(yī)符中柱教授治療結(jié)直腸癌的經(jīng)典藥對，被廣泛應(yīng)用于CRC的治療[5]。人參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主補五臟、安精神、定魂魄、除邪氣等功效。臨床多被用于抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力及抗菌等[6]。茯苓始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有利水滲濕、健脾寧心等功效。具有利尿、抗氧化、抑菌、抗炎、抗腫瘤、美白、降血脂、抗癲癇及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[7]。兩者合用共筑益氣補血、補益脾胃等功效，對結(jié)直腸癌后期脾胃氣虛型效果顯著。目前針對中醫(yī)藥治療CRC的相關(guān)研究越來越多，但仍集中于單味藥和復(fù)方中藥，對藥對研究較少。本藥對中的人參皂苷、人參多糖等都被證明具有抗腫瘤作用[8]，且茯苓的茯苓酸、茯苓新酸等也被證明對腫瘤有很好的抑制作用[9]。但中藥的化學(xué)成分較多，單成分的研究不能反映中藥的多成分、多靶點的作用特點。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以網(wǎng)絡(luò)學(xué)方法分析藥對、疾病和靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”作用關(guān)系的藥理學(xué)學(xué)科，有利于推進中藥現(xiàn)代藥理學(xué)研究進程。本研究對人參-茯苓藥對活性成分的作用靶點及信號通路與CRC疾病的發(fā)生發(fā)展進行探索，從而闡明人參-茯苓藥對治療CRC的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 結(jié)直腸癌的基因數(shù)據(jù)芯片獲取 在基因表達數(shù)據(jù)庫 GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載與結(jié)直腸癌相關(guān)的GSE128449基因表達譜，由Angel Esteban-Gil等提交，實驗平臺是基于GPL4133平臺?？偣舶?6個樣本，樣本都來自于受試者的息肉基因，其中正常組5個樣本，結(jié)直腸癌31個樣本。

1.2 差異基因的獲取與分析 使用在線分析軟件GEO2R對基因進行分組分析，分為結(jié)直腸癌組和正常人組。設(shè)置P值和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）進行差異基因的篩選。認為當(dāng)P＜0.01并∣log2FC∣＞1.5時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用ImageGP（www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/）在線制作火山圖，Morpheus在 線 工 具（https：//software.broadinstitute.org/morpheus/）制作熱圖。

1.3 人參-茯苓藥對成分靶點的獲取 使用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中輸入人參、茯苓，設(shè)置預(yù)測候選目標(biāo)積分＞20，P＜0.05，獲得人參-茯苓藥對的化合物和可能干預(yù)的靶基因。

1.4 關(guān)鍵靶點的篩選及構(gòu)建蛋白作用網(wǎng)絡(luò) 將人參、茯苓及結(jié)直腸癌的靶基因取交集獲取核心靶點基因，并制作韋恩圖，將核心靶基因在使用PPI分析數(shù)據(jù)庫STRING構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置人種為“Homo sapiens”，最低互作閾值為 0.4，制作 PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 靶點及其對應(yīng)有效成分的預(yù)測 將1.4所獲取的核心靶點基因?qū)隑ATMAN-TCM系統(tǒng)，得到每個靶點對應(yīng)的有效成分，使用Cytoscape軟件構(gòu)建疾病-靶點-藥物有效成分網(wǎng)絡(luò)。在生成的網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點代表化合物、蛋白質(zhì)或疾病，連線代表相互作用關(guān)系。

1.6 核心靶點的GO分析和KEGG通路富集分析使用R語言對“人參-茯苓”藥對治療CRC的關(guān)鍵靶點進行GO分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，設(shè)置 P＜0.05，Q＜0.05.分析結(jié)果以氣泡圖展示，僅展示前20個。

1.7 核心蛋白的聚類功能模塊分析 將STRING所獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件，使用MCODE插件對差異基因進行模塊化分析，篩選積分較高的核心基因，并對核心基因進行生物過程GO分析和KEGG分析，以P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌差異基因收集結(jié)果 CRC患者和正常人之間共有892個差異基因，其中上游基因307個，下游基因585個。圖1展示了差異基因的火山圖，圖3只展示了前30個上調(diào)基因和前30個下調(diào)基因的熱圖。

圖1 結(jié)直腸癌差異基因的火山圖分析

2.2 關(guān)鍵靶點的篩選 從BATMAN-TCM中設(shè)置預(yù)測候選目標(biāo)積分＞20，P＜0.05，獲得人參的化合物有293個，其中155個化合物含有結(jié)構(gòu)信息，可能干預(yù)的靶基因有1 338個；茯苓的化合物共54個，其中21個化合物含有結(jié)構(gòu)信息，可能干預(yù)的靶基因有503個；將它們與結(jié)直腸癌的差異基因取交集共獲得關(guān)鍵基因23個，分別為：LEP、APOE、HTR3A、NPPA、TNF、PTGS2、HMBS、CREB1、AKR1C1、NFKB1、COX5A、 RXRA、 CAMK2D、 PPARG、 HDAC9、GABRA2、IL6、MAOB、 NFIB、 RAB3B、 GRIN1、ADK、RRM2B。結(jié)果見圖2。

圖2 核心基因?qū)ふ翼f恩圖

2.3 化合物分子-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 在設(shè)置核心靶點基因的積分＞20后，篩選靶點基因的化合物，共獲得人參相關(guān)的化合物有53個，β-欖香烯、δ-欖香烯、草烯、三磷酸腺苷、蝙蝠葛堿、腐胺、腺苷、木糖、鼠李糖、石竹胺、蔗糖、棕櫚酸、3，5-二甲基-4-甲氧基苯甲酸、腺嘌呤、γ-谷甾醇、甘露糖、Ginsenol、棕櫚酸甲酯、20（S）-原人參二醇、原人參二醇、原人參三醇（皂苷）、尿苷、香茅醇、膽堿、欖香素等。其中的20（S）-原人參二醇、原人參二醇、原人參三醇是人參皂苷的特征類型，已被實驗證明有助于腫瘤的治療[10]。茯苓相關(guān)的化合物有11個，分別為齒孔醇、麥角胺、八仙花酸、脫氫苯甲酸、對羥基苯甲醇、腺嘌呤、多孔酸B、麥角固醇、茯苓酸、Undecan-2-Ol、月桂醛，其中茯苓酸已經(jīng)被證明可調(diào)節(jié)誘導(dǎo)細胞周期停止和細胞凋亡來達到抗癌作用[11]。如圖4所示，將化合物和核心靶點基因構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖形，連線代表相關(guān)性，分析網(wǎng)絡(luò)圖共含有87個節(jié)點，其中代表人參活性成分的節(jié)點有53個，茯苓的活性成分節(jié)點有11個，節(jié)點與節(jié)點之間的作用關(guān)系共209條，其中腺嘌呤（Adenine）為人參、茯苓共有的化合物。

圖3 前60個結(jié)直腸癌差異表達基因的熱圖分析

圖4 人參-茯苓活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將所獲得的23個靶點基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，如圖5所示。PPI網(wǎng)絡(luò)中共包含節(jié)點23個，38條相互作用關(guān)系。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO生物過程分析和KEGG通路分析 對23個關(guān)鍵靶點進行細胞組分、分子功能與生物過程富集分析，其主要富集于發(fā)射器門控離子通道活動、發(fā)射機門控通道活動、單羧酸結(jié)合、激素受體結(jié)合、羧酸結(jié)合、細胞外配體門控離子通道活性、肌動蛋白結(jié)合、核受體活動、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體活性、受體配體活性、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等生物學(xué)過程。見圖6，展示了前20位GO分析結(jié)果（氣泡大小代表基因富集個數(shù)，顏色深淺代表P值大?。?。

人參-茯苓藥對治療CRC的關(guān)鍵靶點基因進行KEGG分析，其主要富集于TNF信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、NOD樣受體信號通路、PI3K/Akt信號通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、病毒致癌作用、AMPK信號通路、PPAR信號通路、IL-17信號通路等，以上通路對CRC的發(fā)病、進展、侵襲、轉(zhuǎn)移都有著關(guān)鍵性的作用。見圖7，展示了前20位KEGG信號通路富集分析。

2.6 核心蛋白基因篩選 通過Cytoscape中Cyto－Hubba插件進行Hub（核心）基因的篩選，使用MCC算法，顯示前10個積分較高的基因，分別為TNF、PPARG、CREB1、PTGS2、IL6、LEP、APOE、NFKB1、RXRA、GRIN1。見圖 8，其中顏色越深，積分越高。后續(xù)對核心基因進一步PPI分析，得出其主要富集于TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、破骨細胞分化、PI3K/Akt信號通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、NOD樣受體信號通路、NF-κB信號通路等，主要參與生物合成過程和代謝過程的積極調(diào)節(jié)、甾醇運輸、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、細胞死亡、細胞增殖的負調(diào)節(jié)以及RNA代謝過程的積極調(diào)節(jié)等生物過程。

圖6 關(guān)鍵靶點的GO分析結(jié)果

圖7 關(guān)鍵靶點的KEGG分析結(jié)果

圖8 核心基因篩選

圖9 TNF信號通路

3 討論

中醫(yī)學(xué)認為CRC屬于“鎖肛痔”“積聚”“臟毒”“腸蕈”等范疇?！鹅`樞·水脹》說：“腸覃何如？岐伯曰：寒氣客于腸外，與衛(wèi)氣相搏，……肉乃生。其始也，大如雞卵，稍以益大，至其成也，如懷子之狀，久者離歲，按之則堅，推之則移，……”中醫(yī)認為結(jié)直腸司糟粕傳送，CRC的發(fā)生是因正氣虧虛，邪毒入侵，正氣已虛，無力抗邪，致邪氣留內(nèi)，氣、瘀、毒停滯于大腸，大腸傳導(dǎo)失司，日久則積聚于腸內(nèi)，發(fā)為大腸癌。故結(jié)直腸癌與正氣虧虛、外邪入侵密切相關(guān)，補虛兼以解毒散結(jié)是治療CRC的主要治法。人參、茯苓作為常用的補氣健脾中藥，合用能益氣補血、健脾和胃，使正氣得以恢復(fù)，在中醫(yī)藥防治CRC中被廣泛運用。近年來大量研究都表明，人參、茯苓對CRC有著較好的防治效果[12-14]。

本研究共篩選出63個有效成分，關(guān)鍵靶點基因23個，通過有效成分-靶點基因-疾病網(wǎng)絡(luò)，共得到87個節(jié)點，相互作用關(guān)系連線209條。對關(guān)鍵的靶點基因進行GO分析和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)其作用主要涉及代謝途徑、細胞凋亡、細胞增殖、癌癥傳導(dǎo)路徑等多個方面。

通過文獻分析，發(fā)現(xiàn)人參的有效成分β-欖香烯可通過下調(diào)miR-191改善結(jié)直腸癌細胞對5-FU的抗性，抑制Wnt/β-catenin途徑，誘導(dǎo)細胞凋亡，從而治療結(jié)直腸癌[15]。有實驗證明δ-欖香烯可調(diào)節(jié)細胞凋亡途徑，誘導(dǎo)惡性腫瘤細胞周期停滯[16]。蝙蝠葛堿是人參的活性成分，廣泛應(yīng)用于炎癥性疾病中，近年來也發(fā)現(xiàn)可用于防治結(jié)直腸癌，其途徑是通過抑制NF-κB活性及其下游基因的表達影響細胞增殖、侵襲和誘導(dǎo)細胞凋亡[17]。腐胺是細胞合成或從飲食或腸道細菌中獲得的小陽離子胺。有研究發(fā)現(xiàn)外源性多胺可能對結(jié)直腸的健康有益，提示了人參中的腐胺可能是治療結(jié)直腸癌的有效化合物[18]。有研究證明腺苷可通過甲基化途徑，抑制細胞增殖，促進結(jié)直腸細胞凋亡[19]。有研究表明甘露糖受體（MR）在結(jié)直腸癌組織中顯著高表達，可作為結(jié)直腸癌患者的新型生物標(biāo)記物[20]。原人參二醇是一種腸道細菌產(chǎn)生的人參代謝產(chǎn)物，可干擾脂質(zhì)代謝并誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和p53促進結(jié)直腸癌細胞的凋亡[21]。另有實驗證明原人參二醇可增加化療藥物尿嘧啶對結(jié)直腸癌的抑制作用[22]。有效化合物中20（S）-原人參二醇、原人參二醇和原人參三醇都是人參中皂苷的特征類型，已被實驗證明有助于癌癥的治療[10]。膽堿是人體必需的營養(yǎng)素，對從細胞維持到產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)的各種功能都是必需的，有研究發(fā)現(xiàn)血清膽堿水平對預(yù)測所有解剖亞位點的結(jié)直腸癌風(fēng)險具有很強的預(yù)后價值，較高的血清膽堿水平與結(jié)直腸癌風(fēng)險增加有關(guān)[23]。而茯苓的有效成分麥角甾醇的過氧化物也被發(fā)現(xiàn)能下調(diào)β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)，影響CRC細胞的增殖和凋亡，從而發(fā)揮其多癌癥的防治作用[24]。茯苓新酸B屬茯苓中三萜類成分，可以抑制癌癥細胞的活性，抑制腫瘤的生成[14]。其他有效成分雖尚未發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌有直接關(guān)系，但可作為未來深入研究的內(nèi)容。

通過對關(guān)鍵基因進行篩選，獲得積分最高的10個基因，分別為腫瘤壞死因子（TNF）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、CAMP響應(yīng)元件結(jié)合蛋白 1（CREB1）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶 2（PTGS2）、白細胞介素 6（IL6）、瘦素（LEP）、載脂蛋白 E（APOE）、核因子 kappa b 亞單位 1（NFKB1）、維甲酸X受體α（RXRA）、谷氨酸離子型受體NMDA型亞基1（GRIN1）。其中TNF是多功能促炎細胞因子，主要由巨噬細胞分泌，參與細胞增殖、分化、凋亡等生物過程，與其相關(guān)的疾病包括自身免疫、癌癥等，在眾多試驗中被證明是癌癥進展的重要因素，也是癌癥中重要的檢測指標(biāo)，減少TNF基因的表達可以延緩腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[25，26]。PPARG是脂肪細胞分化的調(diào)節(jié)因子，通過抑制NF-κB介導(dǎo)的促炎反應(yīng)，作為腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，與癌癥密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)PPARG基因的多態(tài)性可能是CRC的保護因子，會降低整體患CRC的風(fēng)險[27]。PTGS2是前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶，在癌細胞中PTGS2是前列腺素E2（PGE2）產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟，其在調(diào)節(jié)運動性、增殖和對細胞凋亡的抗性中起重要作用，研究表明其是CRC預(yù)防和治療的靶標(biāo)[28]。IL6是炎癥和B細胞成熟中起作用的細胞因子，主要參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥傳導(dǎo)過程，有研究發(fā)現(xiàn)通過阻斷IL6信號傳導(dǎo)可減少結(jié)腸相關(guān)腫瘤的發(fā)生[29]。也有研究表明人結(jié)腸中TNF-α和IL6的升高會促進CRC的發(fā)生[30]。NFKB1是NF-κB的亞基1，幾乎所有細胞類型中存在的多效轉(zhuǎn)錄因子，主要參與炎癥、免疫、分化、腫瘤發(fā)生和細胞凋亡，同時也是NF-κB信號通路的關(guān)鍵基因，而NF-κB信號通路已被證明可用于調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的進展[31-32]。人參-茯苓可能主要通過TNF、PPARG、PTGS2、IL6、NFKB1等靶點來達到治療作用的。

從富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其主要與炎癥傳導(dǎo)和癌癥相關(guān)信號通路密切相關(guān)，包括TNF信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、NOD樣受體信號通路、PI3K/Akt信號通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、病毒致癌作用、AMPK信號通路、PPAR信號通路、IL-17信號通路等。其中TNF的信號傳導(dǎo)中的TNF-α、TNF-β都被證明與CRC密切相關(guān)，可調(diào)節(jié)炎癥轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）及其生物標(biāo)志物，影響腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和細胞存活[33]。NF-κB信號通路主要參與免疫應(yīng)答和炎癥調(diào)節(jié)，與癌癥的發(fā)生和進展密切相關(guān)，其主要通過參與細胞增殖和凋亡途徑來介導(dǎo)CRC的發(fā)展[34-35]。PI3K/Akt信號傳導(dǎo)也是癌癥中最易被激活的傳導(dǎo)途徑之一，其在CRC中被過度激活，導(dǎo)致癌細胞凋亡減少，刺激癌細胞的生長[36]等。以上證據(jù)表明人參-茯苓藥對主要是通過炎癥傳導(dǎo)和腫瘤相關(guān)傳導(dǎo)途徑來防治CRC的。

綜上，本研究使用生物信息分析技術(shù)，挖掘到人參-茯苓藥對中176個有效化合物，共同干預(yù)的潛在靶基因415個，CRC疾病相關(guān)靶基因892個，其中藥對-疾病共同的靶點共23個，通過對核心靶點基因進行GO分析和KEGG分析得出，人參-茯苓藥對可能通過干預(yù) TNF、PTGS2、IL6、LEP、APOE、NFKB1 等靶基因，調(diào)控癌癥、炎癥相關(guān)信號通路，TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、PI3K/Akt信號通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)途徑、NOD樣受體信號通路、NF-κB信號通路等，從而通過調(diào)控細胞凋亡和炎癥反應(yīng)來防治CRC。但本試驗僅從GEO數(shù)據(jù)中獲取了36個樣本，未包含大樣本的基因組分析，也受限于算法和軟件的限制，目前只是進行實驗數(shù)據(jù)的分析整理，仍需后期實驗的進一步驗證。