水飛薊素腸溶聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒的制備及體外釋藥研究Δ

何 靜，邱妍川，楊延音，劉松青，林鳳云，江尚飛，朱照靜（1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校繼續(xù)教育學(xué)院，重慶 4011；.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院，重慶 4011；.第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 40008）

水飛薊素腸溶聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒的制備及體外釋藥研究Δ

何 靜1＊，邱妍川2，楊延音2，劉松青3，林鳳云2，江尚飛2，朱照靜2（#1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校繼續(xù)教育學(xué)院，重慶 401331；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，重慶 401331；3.第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400038）

目的：制備水飛薊素腸溶聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米粒，并研究其體外釋藥行為。方法：以羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯（HPMCP）為腸溶材料，采用納米沉淀法制備水飛薊素腸溶PLGA納米粒和水飛薊素PLGA納米粒，觀察其形態(tài)，檢測其粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量、穩(wěn)定性、體外釋放度（Q）。以粒徑、包封率、載藥量為指標(biāo)篩選水飛薊素腸溶PLGA納米粒中PLGA-HPMCP質(zhì)量比。結(jié)果：PLGA-HPMCP的最佳質(zhì)量比為1∶0.25。所制水飛薊素腸溶PLGA納米粒和水飛薊素PLGA納米粒的粒徑分別為224、193 nm，Zeta電位分別為－37.8、－40.7 mV；包封率分別為（74.7±2.2）%、（71.7±2.5）%，載藥量分別為（5.39± 0.24）%、（5.21±0.22）%；4℃下儲存3個月后的滲漏率分別為0.2%、0.5%；人工胃液中Q48h分別為38.6%、70.5%，人工腸液中Q48h分別為80.2%、73.5%。結(jié)論：成功制得水飛薊素腸溶PLGA納米粒，其穩(wěn)定性較好，能有效抑制水飛薊素在人工胃液中的釋放。

水飛薊素；聚乳酸-羥基乙酸共聚物；羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯；納米粒；體外釋放度

水飛薊素（Silymarin）是從菊科植物水飛薊中提取精制而成的一類黃酮類化合物的總稱，主要包含水飛薊賓、水飛薊寧和水飛薊亭等，其中水飛薊賓及其異構(gòu)體異水飛薊賓含量最高，約占該化合物的60%～70%，且具有最強的藥理活性[1]。水飛薊素在臨床上是治療肝臟疾病最為常用的一種植物藥，體外研究證明其可通過抑制核因子κB（NF-κB）細胞發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[2]；還可以通過影響丙型肝炎核心蛋白和NS5A病毒的表達，發(fā)揮治療慢性丙型肝炎病毒感染的作用[3]。此外，臨床研究顯示，水飛薊素可有效用于非酒精性脂肪性肝病的治療[4]，并可減輕抗肺結(jié)核藥物引起的肝損傷[5]，減少化療過程中順鉑造成的腎毒性等[6]。

盡管水飛薊素在體外表現(xiàn)出了較好的藥理活性，但由于其溶解度很低、體內(nèi)吸收較差、生物利用度低，嚴(yán)重影響了其在臨床的使用。目前臨床上使用的水飛薊素片劑或膠囊劑，患者需要每日給藥3次，即每天需使用1.2～1.5 g才能維持有效的血藥濃度。盡管水飛薊素臨床應(yīng)用安全性較好，但高劑量長期使用仍會造成惡心、嘔吐、腹瀉等消化道不良反應(yīng)。為提高水飛薊素的生物利用度，國內(nèi)外研究主要集中于制備其固體分散體、納米脂質(zhì)體、納米混懸劑等[7-8]，能一定程度上改善其體內(nèi)吸收和靶向特征，但目前均未應(yīng)用于臨床。近年來，腸溶納米粒的研究逐漸成為熱點，已有研究顯示其與普通納米粒相比，可使藥物以分子形態(tài)分布于腸溶載體，進一步提高藥物的物理化學(xué)穩(wěn)定性，減少對胃腸道的刺激；此外，以小腸定位給藥可有效減少或避免用藥的個體差異[9-10]。因此，本試驗通過制備水飛薊素腸溶聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米粒，以改善其溶解狀況，降低其在人工胃液中的突釋現(xiàn)象，進一步提高其口服給藥的生物利用度和療效，減少臨床使用的不良反應(yīng)。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010C HT高效液相色譜儀（日本島津公司）；Tecnai G2 20200kV透射電子顯微鏡（廈門億辰科技有限公司）；納米激光粒度儀（德國新柏泰克公司）；超速離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2 藥品與試劑

水飛薊素對照品（西安瑞林生物科技有限公司，批號：130802，純度：＞98%）；PLGA[中國科學(xué)院成都有機化學(xué)研究所，批號：141245-359，乙交酯（GA）-丙交酯（LA）（75∶25）]；羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯（HPMCP，HP55，日本信越化學(xué)工業(yè)株式會社，批號：130906）；聚乙烯醇（PVA，美國Sigma-Aldrich公司）；甘露醇（重慶博方醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；丙酮（重慶川江化學(xué)試劑廠，化學(xué)純）；甲醇為色譜純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 水飛薊素的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Dikma-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 2.77）（48∶52，V/V，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜濾過后使用），流速為1 ml/min；檢測波長為288 nm；柱溫為30℃；進樣量為10 μl。該色譜條件下，水飛薊賓和異水飛薊賓的出峰時間分別為16.7、18.9 min，以兩者峰面積之和計算水飛薊素含量；其他輔料不影響水飛薊素的含量測定。

2.1.2 方法學(xué)考察 按方法學(xué)考察相關(guān)方法進行試驗。水飛薊素峰面積（y）與質(zhì)量濃度（x）的回歸方程為y＝16 548.6x+ 344.1（r＝0.999 8，n＝6），線性范圍為5.03～150.9 μg/ml；日內(nèi)（n＝5）、日間（n＝3）精密度試驗的RSD均小于4.29%；10.06、50.30、100.60 μg/ml水飛薊素溶液的方法回收率分別為（97.68±3.22）%、（98.32±3.51）%、（99.65±1.24）%（n＝5）。

2.2 PLGA納米粒的制備

采用納米沉淀法制備PLGA納米粒。稱取水飛薊素、PLGA各約0.7 g與一定量的HPMCP溶于10 ml丙酮，在磁力攪拌條件下，緩慢滴加到5%PVA水溶液中，調(diào)節(jié)pH至4～8，繼續(xù)攪拌2 h。12 000 r/min（離心半徑15 cm）離心10 min去除非目標(biāo)粒徑顆粒，加入甘露醇6 g，冷凍干燥，得水飛薊素腸溶PLGA納米粒。另精密稱取水飛薊素和PLGA各約0.7 g溶于丙酮中，之后照上述方法制備得到水飛薊素PLGA納米粒。

2.3 包封率和載藥量測定

稱取葡聚糖凝膠，加純化水溶脹、煮沸、放冷、裝柱。取制備好的水飛薊素腸溶PLGA納米?；蛩w薊素PLGA納米粒，采用蒸餾水重新分散為納米?；鞈乙汉螅芪?.0 ml上樣。脫氣后超純水洗脫，流速1.0 ml/min，收集洗脫液，棄去前20 ml洗脫液，取后55 ml，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，甲醇清洗旋蒸瓶并定容。用高效液相色譜法測定水飛薊素含量，計算包封率和載藥量。包封率（%）＝Ws/Wa×100%，載藥量＝Ws/Wnp×100%，式中Wa為水飛薊素投藥量，Ws為包裹在納米粒中的藥物量，Wnp為載藥納米粒的量。

2.4 腸溶材料對水飛薊素腸溶PLGA納米粒的影響

固定水飛薊素和PLGA處方量，以粒徑、包封率和載藥量為指標(biāo)，考察不同比例PLGA-HPMCP（1∶0、1∶0.1、1∶0.25、1∶0.5、1∶0.75、1∶1）對水飛薊素腸溶PLGA納米粒的影響。結(jié)果顯示，PLGA-HPMCP比例在1∶0.25之后，隨HPMCP比例增大，納米粒粒徑增大，但包封率和載藥量趨于穩(wěn)定。因此，本試驗選擇PLGA-HPMCP比例為1∶0.25。不同比例PLGAHPMCP對水飛薊素腸溶PLGA納米粒的影響見表1。

表1 不同比例PLGA-HPMCP對水飛薊素腸溶PLGA納米粒的影響Tab 1 Effects of different ratios of PLGA-HPMCP on enteric-coated silymarin-PLGAnanoparticles

2.5 PLGA納米粒質(zhì)量評價

2.5.1 形態(tài)觀察 按“2.3”項下方法制備水飛薊素腸溶PLGA納米粒和水飛薊素PLGA納米粒的混懸液，采用透射電子顯微鏡觀察納米粒的形態(tài)。結(jié)果顯示，二者均呈圓形。透射電子顯微鏡圖見圖1。

圖1 兩種納米粒的透射電子顯微鏡圖（×2 300）Fig 1 TEM of 2 kinds of nanoparticles（×2 300）

2.5.2 粒徑和Zeta電位 按“2.3”項下方法制備水飛薊素腸溶PLGA納米粒和水飛薊素PLGA納米?；鞈乙海铀♂?0倍，用納米激光粒度儀測定其粒徑和Zeta電位。結(jié)果顯示，二者的平均粒徑分別為224、193 nm，粒徑分布為正態(tài)分布；Zeta電位分別為－37.8、－40.7 mV，表明兩種納米粒均較為穩(wěn)定。兩種納米粒的粒徑分布見圖2。

圖2 兩種納米粒的粒徑分布Fig 2 Particle size distribution of 2 kinds of nanoparticles

2.5.3 含量測定 取水飛薊素腸溶PLGA納米粒和水飛薊素PLGA納米粒，加入甲醇溶解并稀釋混勻，進樣測定水飛薊素含量。結(jié)果，二者水飛薊素的含量分別為（53.96±1.06）、（54.68±1.21）mg/g（n＝6）。

2.5.4 穩(wěn)定性考察 將水飛薊素腸溶PLGA納米粒和水飛薊素PLGA納米粒分別置于25 ml的敞口試管中，4℃下保存，分別于1、2、3個月時取出樣品測定平均粒徑與滲漏率（LR），LR（%）＝（1－EEt/EE0）×100%，式中，EEt和EE0分別為在t時刻的包封率和初始包封率。結(jié)果顯示，二者在4℃下儲存3個月后粒徑基本無變化，LR分別為0.2%、0.5%，具體結(jié)果見表2。

表2 兩種納米粒的穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab 2 Results of stability test of 2 kinds of nanoparticles

2.6 體外釋放度考察

分別取水飛薊素腸溶PLGA納米粒和水飛薊素PLGA納米粒45 mg，放入棕色瓶中，分別加入150 ml人工胃液和人工腸液，37℃氣浴恒溫振蕩，轉(zhuǎn)速100 r/min。分別于試驗前和開始振蕩后0.5、1、2、4、8、12、24、48 h取樣4 ml，并補充等體積的釋放介質(zhì)。接收液用0.22μm的微孔濾膜過濾，以甲醇稀釋后于288 nm波長處測定吸光度，計算累積釋放度，繪制體外釋放曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 兩種納米粒的體外釋放曲線Fig 3 Release curves of 2 kinds of nanoparticles in vitro

由圖3可見，水飛薊素腸溶PLGA納米粒在人工胃液中的釋放速度和累積釋放度明顯低于水飛薊素PLGA納米粒；而在人工腸液中，水飛薊素腸溶PLGA納米粒的釋放速度和累積釋放度略高于水飛薊素PLGA納米粒。這是因為水飛薊素溶解度較差，當(dāng)人工腸液中腸溶材料溶解后，PLGA骨架對藥物的阻滯作用占優(yōu)勢；而水飛薊素腸溶PLGA納米粒粒徑較大，PLGA骨架對藥物溶出的阻滯作用也相對較差，所以水飛薊素溶出更快、溶出量更大。

3 討論

PLGA是目前開發(fā)最為成功的一種生物可降解聚合物，可在機體內(nèi)降解為乳酸和乙醇酸，進一步分解為二氧化碳和水排出體外，具有較好的生物相容性。其也是目前美國FDA和歐盟藥品監(jiān)管局（EMA）均批準(zhǔn)的一種血管外給藥的藥物傳遞系統(tǒng)，可用于多種藥物制劑的處方，包括親水性、疏水性藥物，也包括各種大分子或小分子藥物，可有效用于延緩藥物在體內(nèi)的釋放，降低藥物在體內(nèi)的代謝速度以及實現(xiàn)藥物的靶向給藥[11]。

由于PLGA納米粒在胃液中有較強的突釋現(xiàn)象，因此，本試驗在制備水飛薊素PLGA納米粒的基礎(chǔ)上，開發(fā)其腸溶劑型，以降低其在胃液中的突釋，提高其在腸道的吸收，從而提高其口服給藥的生物利用度；同時，還能有效避免其對胃腸道的刺激，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。從研究結(jié)果看，水飛薊素腸溶PLGA納米粒能有效抑制水飛薊素在人工胃液中的釋放。此外，筆者還需進一步試驗評價其口服給藥后體內(nèi)的靶向作用，為其制劑的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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Preparation and in vitro Drug Release of Enteric-coated Silymarin-PLGA Nanoparticles

HE Jing1，QIU Yanchuan2，YANG Yanyin2，LIU Songqing3，LIN Fengyun2，JIANG Shangfei2，ZHU Zhaojing2（1.College of Extended Education，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 401331，China；2.College of Pharmacy，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 401331，China；3.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital to Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

OBJECTIVE：To prepare enteric-coated silymarin-PLGA nanoparticles，and to study its in vitro release behavior. METHODS：Using HPMCP as enteric-coated material，nanoprecipitation method was used to prepare enteric-coated silymarin-PLGA nanoparticles and silymarin-PLGA nanoparticles.The morphology of nanoparticles were observed，and the particle size，Zeta-potential，encapsulation efficiency，drug-loading amount，stability and in vitro release rate（Q）were detected.The ratio of PLGA-HPMCP in enteric-coated silymarin-PLGA nanoparticles was screened by using particle size，encapsulation ratio and drug-loading capacity as indexes.RESULTS：The best PLGA-HPMCP ratio was 1∶0.25.The particle size of enteric-coated silymarin-PLGA nanoparticles and silymarin-PLGA nanoparticles were 224 nm and 193 nm，Zeta potential were－37.8 mV and－40.7 mV；encapsulation ratio were（74.7±2.2）%and（71.7±2.5）%，and drug-loading amount were（5.39±0.24）%and（5.21± 0.22）%；the percolation rates of them were 0.2%and 0.5%at 4℃ 3 months later；Q48hof them in simulated gastric fluid were 38.6%and 70.5%，and Q48hof them in simulated intestinal fluid were 80.2%and 73.5%，respectively.CONCLUSIONS：The enteric-coated silymarin-PLGA nanoparticles are prepared successfully with good stability，and can effectively inhibit the release of silymarin in simulated gastric fluid.

Silymarin；PLGA；HPMCP；Nanoparticle；Release rate in vitro

R943；R927

A

1001-0408（2016）34-4842-03

2016-02-05

2016-04-22）

（編輯：鄒麗娟）

重慶市科技攻關(guān)計劃項目（No.cstc2012gg-yyjs 10008）；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研計劃項目（No.2012-2-256）

＊副教授，碩士。研究方向：緩控釋制劑。E-mail：hejingt@126. com

#通信作者：教授，博士。研究方向：藥劑學(xué)。E-mail：zhaojing6271@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.28