利用基因編輯技術(shù)改良水稻性狀的研究進(jìn)展與展望

楊 平，陳春蓮，熊運(yùn)華，黃永萍，姚曉云，尹建華

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所,江西 南昌 330200)

基因編輯技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)非常重要的分子生物學(xué)技術(shù)——外源DNA被導(dǎo)入靶細(xì)胞后,與靶細(xì)胞內(nèi)染色體上的同源DNA序列發(fā)生重組,從而整合到靶基因指定的位點(diǎn),在靶位點(diǎn)切割或定點(diǎn)突變,導(dǎo)致遺傳特性改變。隨著基因組編輯技術(shù)日漸成熟,在作物的功能基因研究、遺傳性狀的改良、新品種培育中將發(fā)揮重要作用。在培育作物新品種方面,基因編輯技術(shù)與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)不一樣。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因是將外源DNA轉(zhuǎn)入受體中,使其表達(dá)而獲得優(yōu)良性狀,從而獲得人類所需要的品種;基因編輯技術(shù)只是對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行定點(diǎn)突變或精準(zhǔn)編輯,再編輯后代,通過(guò)遺傳分離完全可以得到?jīng)]有轉(zhuǎn)基因元件的突變體。因此與傳統(tǒng)育種方式相比,基因編輯技術(shù)具有很大的優(yōu)勢(shì)。雖然傳統(tǒng)育種的回交選育也能達(dá)到相同的育種目的,但由于回交培育一個(gè)近等基因系不僅時(shí)間長(zhǎng)、工作量大,并且還會(huì)產(chǎn)生負(fù)面的連鎖累贅效應(yīng)。而利用基因編輯技術(shù)只是定向編輯靶基因,不僅可以縮短培育周期,而且更能有效地避免連鎖的累贅效應(yīng)。

1 基因編輯技術(shù)

近年來(lái),特異性位點(diǎn)核酸酶(site-specific nuclease, SSNs)的發(fā)現(xiàn)與開發(fā)促使基因編輯技術(shù)在基因功能和品種改良方面取得了很大的進(jìn)展。特異性位點(diǎn)核酸酶是指在基因組編輯過(guò)程中對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)切割,引入雙鏈缺口的工具酶[1]。迄今為止,主要有4種SSNs:鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)、成簇規(guī)律性間隔回文短重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats, CRISPR)/Cas9系統(tǒng)。單堿基編輯器技術(shù)是不需要切割DNA形成雙鏈斷裂DSB的,只需經(jīng)化學(xué)反應(yīng),讓基因組中的一對(duì)堿基替換為另一對(duì)堿基,從而達(dá)到精準(zhǔn)編輯基因的目的[2]。

1.1 鋅指核酸酶

鋅指核酸酶(ZFNs)由鋅指蛋白構(gòu)成的DNA識(shí)別域和FokⅠ構(gòu)成的切割域組成,兩者的結(jié)合使靶位點(diǎn)的DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂[3]。因此,細(xì)胞可以通過(guò)同源重組定向修復(fù)(HDR)和非同源末端連接途徑(NHEJ)來(lái)修復(fù)DNA。這兩種修復(fù)機(jī)制都會(huì)產(chǎn)生移碼突變,從而達(dá)到基因突變或編輯的目的。由于FokⅠ內(nèi)切酶需要二聚化才能發(fā)揮活性[4],所以不容易構(gòu)建,而且構(gòu)建的成本很高。構(gòu)建靶向特定位點(diǎn)的ZFN需要對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)8～10個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,然后將這些鋅指結(jié)構(gòu)域與二聚化核酸內(nèi)切酶結(jié)合[5]。

1.2 轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物核酸酶

第二代基因編輯技術(shù)轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)的構(gòu)成與ZFNs相似,由二聚化的FokI核酸內(nèi)切酶的切割DNA結(jié)構(gòu)域和TAL效應(yīng)因子(TALE)的結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)域組成[6]。TALEN同樣不容易構(gòu)建,構(gòu)建成本高,一般只能在基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,TALEN包含核定位信號(hào)(NLS)域、中央結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶功能結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建TALEN需要在靶序列兩側(cè)設(shè)計(jì)兩個(gè)TALEN結(jié)合位點(diǎn),在靶向序列處由二聚化的FokI核酸酶切割，從而產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB),然后通過(guò)HDR或NHEJ修復(fù)。

1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)來(lái)源于古細(xì)菌及原核生物細(xì)菌對(duì)外源病毒和DNA的免疫系統(tǒng)。成簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR) 在古細(xì)菌或細(xì)菌中普遍存在[7]。CRISPR/Cas系統(tǒng)可特異性地識(shí)別外源DNA,切割并沉默外源基因的表達(dá)。CRISPR /Cas系統(tǒng)由CRISPR序列元件和Cas家族組成，它可分為3種類型,即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。目前的CRISPR/Cas系統(tǒng)由Ⅱ型系統(tǒng)改造而來(lái),Ⅱ型系統(tǒng)僅需一種Cas9蛋白參與,相對(duì)比較簡(jiǎn)單,而Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)需要較多種的Cas蛋白共同參與,比較復(fù)雜。CRISPR區(qū)域上游有一段作為啟動(dòng)子啟動(dòng)后續(xù)CRISPR序列轉(zhuǎn)錄的系列,被稱為前導(dǎo)序列,在前導(dǎo)系列調(diào)控下生成前體crRNA (Pre-CRISPR RNA,pre-crRNA)。然后加工為成熟的crRNA,通過(guò)堿基配對(duì),與反式激活的crRNA (trans-acting crRNA, tracrRNA)形成單向?qū)NA (sgRNA)。Cas9核酸內(nèi)切酶的類HNH和類RuvC分別切割DNA兩條互補(bǔ)鏈,在sgRNA的引導(dǎo)下特異性地識(shí)別靶系列并切割形成雙鏈DNA斷裂,從而完成基因組的定向精準(zhǔn)編輯[8]。

1.4 CRISPR/Cpf系統(tǒng)

2015年,美國(guó)麻省理工學(xué)院Zetsche等[9]發(fā)現(xiàn)了同樣來(lái)源于CRISPR系統(tǒng)的Cpf1核酸內(nèi)切酶,包括AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1三種核酸內(nèi)切酶。相比于CRISPR/Cas9系統(tǒng), CRISPR/Cpf系統(tǒng)有如下優(yōu)點(diǎn):(1)Cpf1只需較短一段crRNA識(shí)別靶目標(biāo),不需tracrRNA,而且Cpf1更簡(jiǎn)單、更小、更容易進(jìn)入細(xì)胞;(2)Cpf1的PAM是靶序列為5′端連續(xù)的2個(gè)或3個(gè)胸腺嘧啶(T),擴(kuò)大了基因組編輯的范圍,也是對(duì)CRISPR基因組編輯技術(shù)的一個(gè)重要補(bǔ)充;(3)Cpf1切割目標(biāo)系列產(chǎn)生的是粘性末端,更有利于靶序列的同源重組替換和精準(zhǔn)插入;(4) Cpf1既可以切割DNA,又能切割RNA,有助于構(gòu)建多基因編輯的載體。

1.5 單堿基突變編輯技術(shù)

Komor等[10]開發(fā)出了只需經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)從而讓基因組的一對(duì)堿基發(fā)生替換的單堿基編輯器,包括胞嘧啶堿基編輯器(CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(ABE)。CBE誘導(dǎo)鳥嘌呤(G)變成腺嘌呤(A),誘導(dǎo)胞嘧啶(C)變成胸腺嘧啶(T); ABE誘導(dǎo)A或T變成G或C。與其它基因編輯技術(shù)不同,單堿基突變編輯技術(shù)不需要核酸內(nèi)切酶在特異位點(diǎn)處切割DNA,只需產(chǎn)生雙鏈斷裂就能達(dá)到精準(zhǔn)編輯的目的。Kai等[11]在水稻中首次就應(yīng)用了ABE編輯器。

2 基因編輯技術(shù)在水稻性狀改良中的應(yīng)用

基因編輯技術(shù)除了應(yīng)用于研究水稻新功能基因組外,最近幾年,應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)等基因編輯技術(shù)在水稻遺傳性狀(產(chǎn)量、品質(zhì)、育性、抗性等性狀)改良、新品種培育方面也取得了較大進(jìn)展(表1)。

2.1 產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)性狀

產(chǎn)量和品質(zhì)是典型的數(shù)量性狀,水稻的產(chǎn)量主要由有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重決定。利用基因編輯技術(shù)已經(jīng)成功改良產(chǎn)量性狀的負(fù)調(diào)控基因包括GS3、DEP1、GS5、GW2、Gn1a和TGW6[12]。Li等[13]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)編輯Gn1a(OsCKX2)、DEP1、GS3和IPA1，獲得的突變體表型與以前報(bào)道的一樣,單株產(chǎn)量得到了提高。Butt等[14]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向編輯CCD7基因,獲得了多分蘗突變體。Xu等[15]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時(shí)突變3個(gè)粒重相關(guān)基因GW2、GW5和TGW6,獲得了千粒重比野生型增加29.3%的突變體。Li等[16]利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的多基因載體同時(shí)組編輯3個(gè)負(fù)調(diào)控生育期基因Hd2、Hd4和Hd5,獲得了早熟的突變體。水稻種子的貯藏特性主要受脂氧合酶(LOXs)的調(diào)控,在14個(gè)LOX基因家族中有3個(gè)基因(LOX1、LOX2和LOX3)在負(fù)調(diào)控水稻種子的貯藏性。Ma等[17]應(yīng)用TALENs定向突變LOX3基因，提高了水稻種子的耐貯藏能力。Shan等[18]和Shao等[19]分別利用TALENs和CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻的香氣基因OsBADH2進(jìn)行編輯,獲得了香米突變體。Miao等[20]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯調(diào)控水稻營(yíng)養(yǎng)基因PYL家族,獲得了生長(zhǎng)力和產(chǎn)量增加的突變體。Ma等[21]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除控制直鏈淀粉含量的基因OsWaxy,獲得了秈稻和粳稻的糯性品系。

表1 基因組編輯技術(shù)在水稻遺傳改良中的應(yīng)用

2.2 育性相關(guān)性狀

水稻雜種優(yōu)勢(shì)利用法包括三系法和兩系法,其中環(huán)境敏感型兩用不育系由細(xì)胞核基因PMS3、TMS5調(diào)控。Zhou等[22]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變TMS5基因,得到了溫敏不育系,可用于兩系雜交稻的培育。Li等[23]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變粳稻CSA基因,得到了2個(gè)反光敏不育系(9522csa和JY5Bcsa)和1個(gè)光溫敏不育系(KY131csa-4)。李三峰等[24]通過(guò)編輯品占中的TMS5、Pi21和Xa13基因,創(chuàng)制出多個(gè)tms5/pi21/xa13純合突變的水稻新株系；表型鑒定表明，不同突變方式的純合株系在高溫28 ℃下不育,在低溫23 ℃下轉(zhuǎn)可育；同時(shí),這些純合突變株系對(duì)稻瘟病和白葉枯病的抗性顯著增強(qiáng)。

2.3 生物和非生物脅迫相關(guān)性狀

近年來(lái),應(yīng)用基因編輯的方法大大增強(qiáng)了水稻對(duì)病蟲害和逆境的抗性。運(yùn)用TALENs定向敲除OsSWEET14啟動(dòng)子區(qū)的效應(yīng)蛋白綁定元件(effector-binding element, EBE),解除了效應(yīng)蛋白與OsSWEET14啟動(dòng)子的結(jié)合,從而使水稻對(duì)白葉枯病的抗性得到了提高[25-27]。Cai等[28]運(yùn)用TALEN技術(shù)修飾Os09g29100基因啟動(dòng)子中的Tal7結(jié)合位點(diǎn),從而增強(qiáng)了水稻對(duì)細(xì)菌性條斑病的抗性。Wang等[29]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除水稻品種空育131中的1個(gè)編碼AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子的基因OsERF922(該基因負(fù)調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病的抗性),獲得了抗稻瘟病株系。Xu等[30]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯了水稻的除草劑(苯達(dá)松)抗性基因BEL,使該基因的功能傷失，從而使水稻對(duì)苯達(dá)松敏感。Sun等[31]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)定向?qū)λ続LS基因的密碼子進(jìn)行替換,并且通過(guò)分離獲得了沒(méi)有轉(zhuǎn)基因元件的抗除草劑水稻株系。

2.4 其它性狀

鎘(Cd)含量超標(biāo)嚴(yán)重影響人體健康。Tang等[32]利用CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)對(duì)秈稻的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsNramp5進(jìn)行突變,田間試驗(yàn)表明,突變秈稻株系谷粒中的Cd濃度低于0.05 mg/kg,而野生型谷粒中的Cd濃度為0.33～2.90 mg/kg。Wang等[33]通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在秈粳雜交稻“春優(yōu)84”中同時(shí)敲除PAIR1、REC8、OSD1 和MTL這4個(gè)內(nèi)源基因,獲得了可以發(fā)生無(wú)融合生殖的Fix (Fixation of hybrids)材料； Fix植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段表現(xiàn)正常,但其育性明顯下降；通過(guò)細(xì)胞倍性檢測(cè),在其子代中獲得了細(xì)胞倍性為二倍體且基因型與親本完全一致的植株,這些F2代植株的表型也與其F1代雜交稻高度相似。由此證明,通過(guò)基因編輯技術(shù)同時(shí)編輯這4個(gè)基因,可以將無(wú)融合生殖特性引入到雜交稻當(dāng)中,從而實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)的固定。

3 小結(jié)與展望

水稻的有利性狀大部分是數(shù)量性狀,由多基因調(diào)控。基因調(diào)控性狀的方式分為正調(diào)控和負(fù)調(diào)控。目前的基因組編輯技術(shù)主要針對(duì)負(fù)調(diào)控基因,而對(duì)于替換及插入目的片段的獲得性突變的效率很低,因此,未來(lái)的任意精準(zhǔn)編輯水稻基因技術(shù)將會(huì)促進(jìn)功能基因組研究與新品種改良。

水稻功能基因的深入研究及重要功能基因的克隆為利用基因編輯技術(shù)改良水稻遺傳性狀、獲得優(yōu)良性狀品種或種質(zhì)資源提供了遺傳基礎(chǔ)。將來(lái)可以通過(guò)基因編輯技術(shù)在水稻品質(zhì)、產(chǎn)量、抗性等方面取得新突破。

基因編輯技術(shù)是一個(gè)新技術(shù),也同樣面臨著前所未有的機(jī)遇和安全問(wèn)題的挑戰(zhàn)。美國(guó)認(rèn)為由細(xì)胞自我修復(fù)產(chǎn)生的突變體不屬于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物,利用基因編輯技術(shù)獲得的作物新品種不屬于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品(GMO)[34]。歐盟則認(rèn)為非自然產(chǎn)生的基因編輯產(chǎn)品就是GMO,然而通過(guò)化學(xué)和物理誘變獲得的突變體在他們看來(lái)又不是GMO。顯然,基因編輯的突變與化學(xué)、物理誘變?cè)诒举|(zhì)上是一樣的,只是手段(技術(shù))不一樣。然而最近歐盟也傾向于將基因組編輯作物定義為非GMO[35]。