金連菊復(fù)方制劑對大鼠的亞慢性毒性試驗(yàn)

蘭宗寶,俸祥仁,張 鑫,何莫斌,陳德元,羅 麗,陳 燕

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)科技信息研究所,廣西 南寧 530007;2.廣西南寧強(qiáng)微農(nóng)牧科技有限公司,廣西 南寧 530001;3.廣西百朋種畜場,廣西 柳州 541502)

隨著我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,養(yǎng)豬場規(guī)模不斷擴(kuò)大,豬病也日趨復(fù)雜,致使豬場亂用、濫用化學(xué)抗生素的現(xiàn)象頻繁發(fā)生,不僅容易誘發(fā)病原菌的耐藥性及造成生態(tài)環(huán)境污染,還會導(dǎo)致豬肉藥物殘留,嚴(yán)重影響我國食品安全及危害人體健康[1]。為此,國家層面先后制訂發(fā)布了《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》、《藥物飼料添加劑使用規(guī)范》、《動物性食品中獸藥最高殘留限量》等法規(guī)制度,以期進(jìn)一步規(guī)范抗生素在養(yǎng)豬行業(yè)中的使用準(zhǔn)則。中藥具有天然的保健及藥用成分,可提高機(jī)體的免疫力,同時(shí)具有抗病毒及抗應(yīng)激等活性作用[2,3],且毒副作用小,不易誘發(fā)病原菌產(chǎn)生耐藥性,目前在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中已得到廣泛應(yīng)用[4]。中藥復(fù)方制劑是由兩種或兩種以上的中藥材組方而成,其有效成分復(fù)雜且多不明確,因此需通過毒理學(xué)試驗(yàn)檢驗(yàn)組方藥物間的配伍效果,以減少或避免藥物在臨床應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生拮抗作用等不良反應(yīng)[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),金銀花、連翹、野菊花、烏梅和五倍子等中藥對大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和放線桿菌等6種豬場常見病原菌均表現(xiàn)為高度敏感,對應(yīng)的最小抑菌濃度(MIC)較低[6],在此基礎(chǔ)上研發(fā)出了金連菊復(fù)方制劑(金銀花15 g,連翹25 g,野菊花25 g,烏梅15 g,五倍子20 g)。根據(jù)新獸藥臨床前研究階段要求,需采用實(shí)驗(yàn)動物開展相關(guān)安全性試驗(yàn)以考察產(chǎn)品開發(fā)的可行性及驗(yàn)證藥物的安全性。因此,我們以Wistar大鼠為動物模型開展了金連菊復(fù)方制劑的亞慢性毒性試驗(yàn),旨在評價(jià)其用藥安全性,為金連菊復(fù)方制劑的獸醫(yī)臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金連菊復(fù)方制劑的中藥原材料(金銀花、連翹、野菊花、烏梅和五倍子)購自廣西玉林市中藥材專業(yè)市場。Wistar大鼠(雌、雄各半)購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,共100只,體重80～120 g/只。在試驗(yàn)期間飼喂大鼠全價(jià)飼料,室溫控制在18～22 ℃,相對濕度為40.0%～70.0%。本試驗(yàn)所用的主要儀器設(shè)備有體視顯微鏡、手提式壓力蒸汽消毒器、生化無菌培養(yǎng)箱、血細(xì)胞分析儀、生化分析儀和尿液分析儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中藥材處理 按組方配比精確稱取烏梅、連翹、五倍子和野菊花總量500.0 g,在煎煮前以5～7倍蒸餾水浸泡1～2 h,煎煮30 min后收集藥液；再加入3～5倍蒸餾水，繼續(xù)煎煮30 min；合并兩次藥液，濃縮至生藥含量為1.0 g/mL；以4000 r/min離心20 min,收集上清液裝瓶備用。用95%乙醇浸泡金銀花6～8 h,收集浸提液；藥渣再用95%乙醇浸泡4～6 h；合并兩次浸提液，在80 ℃下加熱回流1.5～2.0 h,收集浸提液,過濾,濃縮至生藥含量1.0 g/mL,裝瓶備用。按85∶15的比例合并上述兩種藥液,以手提式壓力蒸汽消毒器滅菌30 min,即獲得金連菊復(fù)方制劑。在試驗(yàn)前濃縮或稀釋至設(shè)計(jì)的用藥濃度。

1.2.2 試驗(yàn)分組及給藥 對Wistar大鼠先進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,然后隨機(jī)分5組,每組20只,雌、雄各半。其中4組為給藥劑量組(Ⅰ～Ⅳ組),分別經(jīng)口灌服不同濃度(0.5、1.0、2.0和5.0 g/mL)的金連菊復(fù)方制劑,每只Wistar大鼠每天灌服一次,按每100 g體重灌服1.5 mL的劑量給藥;對照組(CK)灌服蒸餾水。連續(xù)給藥90 d,在試驗(yàn)期間每日觀察并記錄大鼠的活動、進(jìn)食及飲水情況,每周稱重一次。

1.2.3 測定指標(biāo)及方法 停藥后第2天對所有Wistar大鼠進(jìn)行眼球采血,將每只Wistar大鼠的血樣分成2份:一份以抗凝劑抗凝,用于血常規(guī)指標(biāo)檢測;另一份靜置析出血清,用于檢測血清生化指標(biāo)。完成采血工作后,每組隨機(jī)選取10只Wistar大鼠進(jìn)行剖檢,稱取心臟、肝臟、脾臟、甲狀腺、腎臟等主要器官的重量,計(jì)算各器官的臟器系數(shù);同時(shí)采集心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胃、腸道等器官組織進(jìn)行固定和制作石蠟切片,用于組織病理學(xué)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

對試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行整理,用DPS進(jìn)行單因素方差分析,并以Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 金連菊復(fù)方制劑對Wistar大鼠體重增長的影響

在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi),各給藥劑量組Wistar大鼠未見死亡和明顯的中毒癥狀,生長活動基本正常。由表1可知：在試驗(yàn)0～8周期間各給藥劑量組Wistar大鼠的體重增長幅度與CK無顯著差異,且均表現(xiàn)為雄性Wistar大鼠的體重增長幅度大于雌性Wistar大鼠。從第9周開始,Ⅳ組雄性Wistar大鼠的體重增長幅度明顯降低,其中,第9周的增重與CK相比差異顯著(P<0.05),第10～13周的增重與CK相比差異極顯著(P<0.01);Ⅳ組雌性Wistar大鼠從第10周開始其體重增長幅度也明顯降低,與CK相比差異極顯著;而Ⅲ組雄性Wistar大鼠的體重增長幅度從第11周起顯著低于CK。

2.2 金連菊復(fù)方制劑對Wistar大鼠臟器系數(shù)的影響

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)剖檢發(fā)現(xiàn)：Ⅳ組Wistar大鼠的心臟、甲狀腺和腎臟增大,其中,心臟系數(shù)與CK相比呈顯著增加趨勢,甲狀腺和腎臟的臟器系數(shù)與CK相比差異極顯著;而Ⅰ～Ⅲ組Wistar大鼠心臟、肝臟、脾臟、甲狀腺和腎臟的臟器系數(shù)與CK相比差異均不顯著(表2)。

2.3 金連菊復(fù)方制劑對Wistar大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

由表3可知：Ⅲ組Wistar大鼠的血小板數(shù)較CK顯著下降，但其紅細(xì)胞壓積較CK極顯著上升；Ⅳ組Wistar大鼠的血小板數(shù)及血小板壓積均較CK極顯著下降,但其指標(biāo)值均在正常范圍內(nèi);Ⅰ～Ⅱ組Wistar大鼠的各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)與CK間差異均不顯著。說明金連菊復(fù)方制劑對Wistar大鼠的血常規(guī)指標(biāo)基本上無明顯影響。

表1 金連菊復(fù)方制劑對Wistar大鼠體重增長的影響 g/只

注:“*”或“**”分別表示與CK相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。表2～表4與此相同。

表2 金連菊復(fù)方制劑對Wistar大鼠臟器系數(shù)的影響

表3 金連菊復(fù)方制劑對Wistar大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

2.4 金連菊復(fù)方制劑對Wistar大鼠血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知：Ⅳ組Wistar大鼠的血糖含量和堿性磷酸酶活性顯著低于CK,而其尿素氮和肌酐含量極顯著高于CK;Ⅰ～Ⅲ組Wistar大鼠的各項(xiàng)血清生化指標(biāo)與CK間差異均不顯著。說明0.5～2.0 g/mL的金連菊復(fù)方制劑對Wistar大鼠的血清生化指標(biāo)無明顯影響。

表4 金連菊復(fù)方制劑對Wistar大鼠血清生化指標(biāo)的影響

2.5 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

在亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)束后剖檢觀察,發(fā)現(xiàn)不同處理組Wistar大鼠的器官組織均未見任何異常和可疑病理變化。采集CK和Ⅳ組Wistar大鼠的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胃、腸道等器官組織制作石蠟切片,僅發(fā)現(xiàn)Ⅳ組Wistar大鼠的腎臟略有變化,其腎小囊間隙增大,但其他器官組織均未觀察到異常病理變化(圖1)。上述結(jié)果表明金連菊復(fù)方制劑對Wistar大鼠臟器組織無損害作用。

圖1 CK和Ⅳ組Wistar大鼠的臟器組織石蠟切片觀察結(jié)果

3 討論

中藥復(fù)方是中醫(yī)用藥的主要形式,是基于辯證的思想觀點(diǎn),按照“君—臣—佐—使”的組方原則,選擇恰當(dāng)?shù)乃幬锒颗湮槎蒣7]。與單方藥物相比,復(fù)方制劑具有改善服用藥品依從性、提高藥物療效、減少不良反應(yīng)、降低用藥費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)[5],目前在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)上已得到廣泛應(yīng)用。丁俊仁等[8]針對新生仔豬腹瀉病,以黨參、金銀花、干姜、半夏、藿香、甘草、茯苓等研制出參金口服液;吳苑瀅等[9]以魚腥草、桔梗、陳皮、茯苓等為原料研發(fā)出魚腥草桔苓合劑,并證實(shí)該合劑對Wistar大鼠無慢性毒性作用,安全性好;肖蕊等[10]在桂柴方劑的基礎(chǔ)上研發(fā)出針對雞風(fēng)寒感冒的桂柴感寒口服液;鄧鑫等[5]以廣西地道藥材苦玄參和桃金娘根為主要藥味，制備獲得了復(fù)方苦玄參顆粒,該顆粒具有清熱瀉火、消炎止痢的功效。本研究中的金連菊復(fù)方制劑是依據(jù)金銀花、連翹、野菊花、烏梅和五倍子等5味中藥對大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和放線桿菌等6種豬場常見病原菌高度敏感而研發(fā)獲得的,以期作為飼料添加劑應(yīng)用于斷奶仔豬的育肥養(yǎng)殖。

中藥復(fù)方制劑是否安全是進(jìn)一步研究其藥理、毒理作用的基本保障,同時(shí)對評價(jià)新藥是否具備研發(fā)價(jià)值具有重要意義,即開展急性毒性試驗(yàn)和亞慢性毒性試驗(yàn)是評價(jià)中藥復(fù)方制劑安全性的必要環(huán)節(jié)[11]。其中,亞慢性毒性試驗(yàn)是通過不同劑量的長期重復(fù)給藥,觀察不同劑量藥物長期在動物體內(nèi)可能發(fā)生的不良反應(yīng),從而判斷藥物對靶器官和受試動物的累積作用,并明確安全的可重復(fù)給藥劑量值區(qū)間,為臨床科學(xué)用藥提供理論依據(jù)[12]。本研究以金連菊復(fù)方制劑連續(xù)灌服Wistar大鼠90 d,是常規(guī)亞慢性毒性試驗(yàn)周期(30 d)的3倍,以期更好地揭示該藥物的亞慢性毒性作用。結(jié)果表明,各劑量組Wistar大鼠除個(gè)別檢測指標(biāo)較CK呈顯著或極顯著升高或降低變化外,整體上其體重增長速率、臟器系數(shù)、血常規(guī)指標(biāo)、血清生化指標(biāo)及主要臟器組織結(jié)構(gòu)與CK相比無明顯變化,說明長期服用金連菊復(fù)方制劑對Wistar大鼠無亞慢性毒性作用,安全性好。但金連菊復(fù)方制劑作為飼料添加劑應(yīng)用于斷奶仔豬育肥養(yǎng)殖的給藥劑量尚需進(jìn)一步研究確認(rèn)。