辣椒堿通過(guò)上調(diào)NLRP3炎性小體誘導(dǎo)胃癌MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)移

趙 麗，華 夏，譚 曄

（恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院急診科，恩施 445000）

胃癌是中國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，并且在全球腫瘤患者中占據(jù)第3位[1]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)中國(guó)胃癌患者例數(shù)占全球的42%左右，每年死亡人數(shù)更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)30萬(wàn)[2]。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期炎性因子的浸潤(rùn)是胃癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要誘導(dǎo)機(jī)制[3-4]。飲食習(xí)慣及生活方式也是誘發(fā)炎癥或者腫瘤的重要原因，其中辣椒堿為辣椒中的主要活性成分[5]，長(zhǎng)期使用過(guò)多的辣椒容易誘發(fā)胃黏膜炎癥反應(yīng)，并且一定濃度范圍的辣椒堿可以誘發(fā)一系列炎癥因子的高表達(dá)，還具有抗凋亡及促進(jìn)血管生成等作用[6-7]。早期發(fā)現(xiàn)辣椒堿能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的增殖[8]，但是與胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究較少，并且炎癥可以促使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[9]。筆者主要探討核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體是否參與辣椒堿促使人胃癌MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)移，證實(shí)炎性通路在辣椒堿誘發(fā)MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 人胃癌MGC-803細(xì)胞 購(gòu)買(mǎi)于武漢巴菲爾生物有限公司（來(lái)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 辣椒堿（山東綠葉制藥，批號(hào)H20060291，純度≥99%），白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（CUSABIO公司，批號(hào) CSB-E04505m），白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（CUSABIO公司，批號(hào)CSB-E05207a），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（CUSABIO 公司，批號(hào) CSB-E02308d），活性氧（ROS）抑制劑 N-乙酰半胱氨酸（NAC，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)CT-20161006），NLRP3抑制劑（美國(guó) Sigma公司，批號(hào)CZ-20170614），NLRP3（批號(hào) ab0252411）、細(xì)胞鈣依粘連蛋白（E-cadherin，批號(hào) ab1025855）、波形蛋白（Vimentin， 批 號(hào) ab1102239）、β -actin （ 批 號(hào)ab2255027）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清（FBS）的完全達(dá)爾伯克改良伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基（含1%的105 U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素）中，培養(yǎng)箱設(shè)置為37℃、5%CO2的恒濕條件，采用15 μmol/L辣椒堿干預(yù)MGC-803細(xì)胞48 h。采用1 μmol/L MCC950 及 1 μmol/L NAC 分別與辣椒堿共同干預(yù)MGC-803細(xì)胞48 h。

1.2.2 ELISA實(shí)驗(yàn) 取各組細(xì)胞（對(duì)照組、辣椒堿組、MCC950+辣椒堿組）培養(yǎng)液上清100 μL加入包被好的ELISA板中，37℃反應(yīng)2 h，用洗滌液洗板3次，每次2 min。扣干后加入生物素化的一抗37℃反應(yīng)1 h，用洗滌液洗板3次，每次2 min?？鄹珊蠹尤肜备^(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，37℃反應(yīng)30 min，用洗滌液洗板5次，每次2 min。最后加入3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色劑，反應(yīng)時(shí)間為15～30 min，加入終止液，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞接種于Transwell小室，貼壁后加入辣椒堿溶液及MCC950/辣椒堿混合液，藥物干預(yù)上室MGC-803細(xì)胞48 h后，結(jié)晶紫染色測(cè)定遷移的細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.2.4 Western Blot實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，采用RIPA裂解液在冰上進(jìn)行細(xì)胞裂解30 min，4℃、13 000 g離心力下離心15 min，吸去蛋白上清自新離心管中，采用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，加入適量樣品緩沖液混勻，100℃煮沸7 min。用12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠塊電泳分離蛋白，完成后轉(zhuǎn)膜。切割不同分子量目的蛋白至對(duì)應(yīng)一抗溶液中（稀釋比均為1∶3 000），4℃震蕩過(guò)夜，采用HRP標(biāo)記的二抗（稀釋比 1∶1 000）37℃孵育 1 h，TBST洗膜 3次后加入ECL顯影液，采用X線(xiàn)曝光。

1.2.5 活性氧ROS檢測(cè) 辣椒堿溶液及MCC950/辣椒堿混合液共同處理細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞懸浮于稀釋好的2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，1∶1 000）液中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 辣椒堿誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子 辣椒堿組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6及TNF-α含量相對(duì)于對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 辣椒堿通過(guò)上調(diào)NLRP3炎性小體誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞遷移 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)辣椒堿組細(xì)胞中NLRP3炎性小體表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低、Vimentin蛋白表達(dá)明顯升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。圖3顯示辣椒堿組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)相對(duì)于對(duì)照組顯著增多，而辣椒堿+MCC950組細(xì)胞遷移數(shù)相對(duì)于對(duì)照組沒(méi)有明顯差異，并且發(fā)現(xiàn)MCC950干預(yù)細(xì)胞后，培養(yǎng)液中炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α含量與對(duì)照組比較沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)圖4。還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MCC950聯(lián)合辣椒堿共同干預(yù)細(xì)胞后，NLRP3炎性小體表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高及Vimentin蛋白表達(dá)明顯降低。

圖1 MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子水平Fig.1 Levels of inflammatory cytokines in MGC-803 cell medium

圖2 NLRP3、E-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of NLRP3，E-cadherin and Vimentin proteins

2.3 辣椒堿通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)激活NLRP3炎性小體 辣椒堿組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高，而NAC可以逆轉(zhuǎn)辣椒堿誘導(dǎo)的ROS含量及NLRP3表達(dá)上調(diào)，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

圖3 MGC-803細(xì)胞遷移能力（×200）Fig.3 Metastasis ability of MGC-803 cells（×200）

圖4 MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子水平Fig.4 Levels of inflammatory cytokines in MGC-803 cell medium

圖5 不同組間ROS水平比較Fig.5 Comparison of ROS in different groups

3 討論

圖6 不同組間NLRP3表達(dá)水平比較Fig.6 Comparison of NLRP3 expression in different groups

腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲是腫瘤進(jìn)一步惡化的重要標(biāo)志，并且細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[10]。在腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中EMT往往處于活化狀態(tài)，表現(xiàn)在間質(zhì)樣標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)升高、上皮樣標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低等[11]。研究發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)可以促使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而且炎性因子的產(chǎn)生還能夠加快EMT進(jìn)程，于是腫瘤炎癥微環(huán)境促使了腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力[12]。NLRP3炎性小體是主要的炎癥調(diào)控元件，其表達(dá)上調(diào)會(huì)激活Cleaved casapse-1的水解成熟，從而誘導(dǎo)炎癥因子IL-1β及炎性通路NF-κB的活化[13]。前期研究報(bào)道NLRP3炎性小體在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，并且其表達(dá)含量的提升可誘導(dǎo)胃腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲[14]。本研究發(fā)現(xiàn)用辣椒堿干預(yù)MGC-803細(xì)胞48 h后，NLRP3炎性小體表達(dá)顯著上升，并且間質(zhì)樣標(biāo)志物Vimentin表達(dá)升高、上皮樣標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，說(shuō)明辣椒堿可誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞發(fā)生EMT，同時(shí)MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α含量顯著升高，說(shuō)明辣椒堿可加劇MGC-803細(xì)胞炎癥反應(yīng)。然而采用NLRP3的特異性抑制劑MCC950干預(yù)MGC-803細(xì)胞后，可以解除辣椒堿誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。

相關(guān)研究提示，氧化應(yīng)激可以促使腫瘤細(xì)胞死亡達(dá)到腫瘤治療的目的，作為機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要分子，ROS能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死及自噬性死亡進(jìn)而抑制腫瘤的惡化[15]。然而近年來(lái)報(bào)道ROS可以作為第二信使參與細(xì)胞內(nèi)多種生理調(diào)節(jié)，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤的遷移及侵襲[16]。機(jī)體產(chǎn)生的ROS可誘導(dǎo)NLRP3炎性小體活化，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體受到ROS刺激后會(huì)使無(wú)活性的caspase-1前體進(jìn)一步活化為有活性的caspase-1，后者能夠把無(wú)活性的IL-1β前體剪切為IL-1β而分泌到細(xì)胞外，進(jìn)而導(dǎo)致下游炎性通路的活化[17]。本研究發(fā)現(xiàn)辣椒堿可以促使胃腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的升高，而加入NAC干預(yù)細(xì)胞后能改善辣椒堿誘導(dǎo)的ROS增高，并且還減弱了細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)，提示ROS在辣椒堿介導(dǎo)的胃癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，但辣椒堿誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的分子機(jī)制尚存在疑惑，需更深層次的研究。

總之，本文研究發(fā)現(xiàn)辣椒堿能誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生進(jìn)而激活NLRP3炎性小體，從而誘導(dǎo)胃腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT并促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移。