加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠胃腸動(dòng)力的影響*

徐 磊，張麗萍，宋瑞雯，陳 穎

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

抑郁癥是一種以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的情感性精神障礙，臨床常伴有納差、胃痛胃脹、噯氣反酸、惡心嘔吐、腹痛腹脹、腹瀉或便秘等胃腸功能紊亂癥狀，且抑郁情緒與胃腸動(dòng)力障礙癥狀相互影響，使該病反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的一種疾病。抑郁癥可能與患者長(zhǎng)期遭遇到的各種各樣的精神和社會(huì)因素等慢性應(yīng)激有關(guān)[1]。研究表明[2]，慢性身心應(yīng)激模型大鼠具有食欲不振和飲食量減少等消化不良癥狀。本課題組前期臨床實(shí)踐證實(shí)：基于調(diào)理脾胃法的加味溫膽湯治療抑郁癥療效肯定，可明顯改善患者抑郁情緒及納呆、腹脹等胃腸動(dòng)力障礙癥狀[3]；相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提示：加味溫膽湯能改善抑郁行為，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)抑郁大鼠中樞和局部神經(jīng)肽神經(jīng)肽Y（NPY）、P 物質(zhì)（SP）、生長(zhǎng)激素抑制素（SS）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）的含量有關(guān)[4-5]。本研究在前期研究工作的基礎(chǔ)上，首次觀察加味溫膽湯對(duì)孤養(yǎng)結(jié)合慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠胃腸動(dòng)力及胃腸組織超微結(jié)構(gòu)的影響，以期進(jìn)一步探討加味溫膽湯的抗抑郁作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用8周齡SPF級(jí)SD健康大鼠[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（軍）2017-0001]，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，造模前進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，篩選行為學(xué)評(píng)分相近的大鼠，編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為3組，每組12只，即：空白對(duì)照組、模型組、加味溫膽湯組。除正常組外，其余組采用目前國(guó)際公認(rèn)的孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激方法復(fù)制抑郁大鼠模型。

1.1.2 藥物 中藥復(fù)方加味溫膽湯（半夏、橘皮、枳實(shí)、竹茹、茯苓、石菖蒲、合歡花、生姜、甘草等）購(gòu)于北京同仁堂天津南開(kāi)大藥房有限公司，選用優(yōu)質(zhì)藥材，經(jīng)中藥植化室鑒定后，水煎濃縮為1.5 g/mL，置4℃冰箱內(nèi)備用。

1.1.3 主要儀器 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：包括曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱（自制長(zhǎng)100 cm、寬100 cm、高40 cm曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱，用墨水將自制曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)部刷黑，在底部用白色油漆筆畫(huà)成面積相等的25個(gè)正方形）、攝像機(jī)、筆記本電腦、超薄切片機(jī)（徠卡UC-7）、透射電子顯微鏡（H-7500，日本日立）。

1.1.4 主要試劑 3%多聚甲醛、4℃預(yù)冷1%戊二醛、37℃預(yù)熱0.9%生理鹽水、10%水合氯醛、4%戊二醛、輸液器、瓊脂糖粉、嗅乙錠、4%多聚甲醛、羧甲基纖維素鈉、奶粉、糖、淀粉和活性炭末由賽東南試劑公司提供。1/15 mol/L磷酸緩沖液、1%四氧化鋨、丙酮、包埋液、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛由河北醫(yī)科大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.5 特殊試劑配制 制備營(yíng)養(yǎng)性半固體糊：參照文獻(xiàn)[6]，取10 g羧甲基纖維素鈉，溶于250 mL蒸餾水中，分別加入奶粉16 g，糖8 g，淀粉8 g和活性炭末2 g，攪拌均勻。配制成300 mL約300 g的黑色半固體糊狀物。冰箱冷藏，用時(shí)恢復(fù)至室溫。本實(shí)驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)性半固體糊，營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)接近日常食物，能更接近反映藥物對(duì)胃排空生理機(jī)能的影響；在營(yíng)養(yǎng)性半固體糊中加入炭末，可同時(shí)觀察藥物對(duì)胃、腸運(yùn)動(dòng)的影響，節(jié)省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

透射電鏡固定液：選用4%戊二醛固定液。戊二醛固定液需用1/15 mol/L磷酸緩沖液配制。磷酸緩沖液的配制方法：A液：磷酸二氫鉀1.816 g溶于200 mL 雙蒸水；B 液：Na2HPO4·12H2O 5.5 g溶于200 mL雙蒸水。4%戊二醛固定液配制（pH7.2～7.4）：A 液：11 mL，B 液：55 mL，50%戊二醛原液：6 mL。新鮮配制，4℃冰箱保存。出現(xiàn)混濁、絮狀物沉淀或pH不準(zhǔn)確時(shí)不能使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 給藥處理 空白組每日正常進(jìn)水、進(jìn)食，模型組、加味溫膽湯組連續(xù)3周造模成功后，其他各組開(kāi)始給藥（相當(dāng)于70 kg成人等效量），模型組胃飼生理鹽水2 mL/（kg·d），每日早晨8：00開(kāi)始，加味溫膽湯組胃飼加味溫膽湯12 g/（kg·d），連續(xù)給藥4周。在造模成功后的給藥期間，為防止模型大鼠抑郁狀態(tài)出現(xiàn)消退，間斷給予除空白組外其他各組慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和刺激來(lái)維持其抑郁狀態(tài)。

1.2.2 造模方法 除空白組外，其他各組大鼠均采用分籠飼養(yǎng)方法，每籠1只，自分組之日起，模型組及加味溫膽湯組接受21 d各種未預(yù)知的應(yīng)激，包括24 h禁食、24 h禁水、通宵照明、4℃冷水游泳5 min、45℃烘箱熱烘5min、夾尾lmin、高速水平振蕩3min、100 V電擊足底l min、懸尾l min，共9種刺激，21 d內(nèi)隨機(jī)安排每日給予1種刺激，每種刺激出現(xiàn)2～3次，同一種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)，使動(dòng)物不能預(yù)知給予的刺激。

1.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 以動(dòng)物穿越曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱底面1個(gè)方塊（四爪均進(jìn)入方格方可計(jì)分）或原地旋轉(zhuǎn)1周記為水平活動(dòng)得1分；以直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分，兩前爪騰空或攀附墻壁均可計(jì)1分，計(jì)算水平活動(dòng)得分與垂直得分總和。分別于造模前、造模21 d后及給藥28 d后測(cè)定各組大鼠水平活動(dòng)得分和垂直活動(dòng)得分，每只鼠每次觀察4 min，去掉之前1 min適應(yīng)時(shí)間，讀取后3 min數(shù)據(jù)，計(jì)算各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總分，比較各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分變化趨勢(shì)。

1.2.4 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 各組大鼠在造模前后及給藥干預(yù)后進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行糖水適應(yīng)，給予2瓶1%的蔗糖水24 h后，再給予1瓶1%的蔗糖水、1瓶純水24 h，12 h時(shí)交換2瓶的位置，禁食禁水24 h，予1瓶1%的蔗糖水、1瓶純水，2瓶位置隨機(jī)放置，觀察其在1 h內(nèi)的糖水和純水的消耗量，并排除飲水瓶滴漏所致的液體消耗量。糖水偏愛(ài)率=糖水消耗/總液體消耗×100%。

1.2.5 胃排空率檢測(cè)各組大鼠胃動(dòng)力 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)向胃中灌入營(yíng)養(yǎng)性半固體糊，并記錄灌胃量，灌胃結(jié)束20 min后處死動(dòng)物，解剖取胃，將胃體稱量并記錄質(zhì)量，沿胃大彎剪開(kāi)、展平胃體，用生理鹽水清洗胃內(nèi)容物，然后用濾紙蘸干胃表面水液，然后對(duì)其稱量記為胃凈質(zhì)量，計(jì)算各組大鼠胃排空率。胃排空率的計(jì)算公式：胃排空率=[1-（胃全質(zhì)量-胃凈質(zhì)量）/總灌胃量]×100%。

1.2.6 小腸推進(jìn)率檢測(cè)各組大鼠腸動(dòng)力 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)向胃中灌入營(yíng)養(yǎng)性半固體糊，灌胃20 min后處死動(dòng)物，打開(kāi)腹腔，分離出腸。用鑷子輕輕提取上端至幽門(mén)、下端至回盲部的腸管，平鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，輕輕將小腸拉成直線，用直尺測(cè)量小腸推進(jìn)指標(biāo)。量小腸全長(zhǎng)（Ll）以及幽門(mén)至炭末所達(dá)最前端的長(zhǎng)度（L2），計(jì)算各組大鼠小腸推進(jìn)率。小腸推進(jìn)率的計(jì)算公式：小腸推進(jìn)率（%）=L2/L1×100%。

1.2.7 透射電鏡檢測(cè)各組大鼠胃腸組織的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)結(jié)構(gòu) 心臟灌流后，摘下整個(gè)胃部，沿胃大彎剖開(kāi)，剪取胃底部胃壁全層大小為1 mm×1 mm×1 mm的組織標(biāo)本2～3塊；分離出結(jié)腸，自離盲腸端約2 cm處向上剪取結(jié)腸組織，剪取大小為1 mm×1 mm×1 mm的組織標(biāo)本2～3塊，于4%戊二醛中固定2～4 h以上，送電鏡室固定。組織塊完成固定后，采用

1/15 mol/L磷酸緩沖液清洗15 min，清洗3次。1%四氧化鋨進(jìn)行后固定2 h，4℃冰箱保存。再次使用1/15 mol/L磷酸緩沖液清洗15 min，清洗3次。分別使用50%、70%、80%、90%、100%丙酮逐級(jí)脫水，每次各15 min，進(jìn)行2次。100%丙酮與包埋液1∶1的比例浸透1 h，100%丙酮與包埋液以1∶3的比例過(guò)夜，純包埋液5 h后，用包埋劑將樣本包埋在包埋板里。置入烤箱聚合：37℃，24 h；60℃，48 h。用超薄切片機(jī)（徠卡UC-7）將樣本切成厚約50 nm的超薄切片。醋酸雙氧鈾45 min、檸檬酸鉛30 min進(jìn)行電子染色。置于電鏡下觀察胃、腸組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 造模前各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；造模 21 d后，模型組、加味溫膽湯組得分低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明造模成功；給藥28 d后，模型組得分低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），加味溫膽湯組得分高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 造模前、造模21 d后、給藥28 d后各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分(x±s)Tab.1 Scores of open field test of each group before the modeling，21 days after modeling，28 days after administration(x±s)分

2.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果 造模前各組大鼠糖水偏愛(ài)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。21 d慢性應(yīng)激后，與空白組比較，其余2組糖水偏愛(ài)率顯著降低（P＜0.01），給藥28 d后，與模型組比較，加味溫膽湯組大鼠糖水偏愛(ài)率顯著增加（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 加味溫膽湯對(duì)大鼠胃動(dòng)力的影響 對(duì)營(yíng)養(yǎng)性半固體食物的胃排空率比較結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組的胃排空率得分顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，加味溫膽湯組的胃排空率得分增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠糖水偏愛(ài)率結(jié)果(x±s)Tab.2 Sugar water preference results of rats in each group(x±s)%

表3 各組大鼠胃排空率得分(x±s)Tab.3 Gastric emptying rate score of rats in each group(x±s)分

2.4 加味溫膽湯對(duì)大鼠腸動(dòng)力的影響 對(duì)營(yíng)養(yǎng)性半固體食物的小腸推進(jìn)率比較結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組的小腸推進(jìn)率得分顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，加味溫膽湯組的小腸推進(jìn)率得分增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠小腸推進(jìn)率得分(x±s)Tab.4 Small intestine propulsion rate score of rats in each group(x±s)分

2.5 胃組織的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 正常組：胃主細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未發(fā)現(xiàn)明顯擴(kuò)張，線粒體分布均勻并呈靜息狀態(tài)，黏原顆粒均勻覆蓋于細(xì)胞表面及胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核核膜結(jié)構(gòu)完整，大小形態(tài)正常規(guī)則，無(wú)明顯染色質(zhì)邊集、濃縮等改變。模型組：大鼠胃主細(xì)胞胞膜結(jié)構(gòu)不完整，核嚴(yán)重固縮、核質(zhì)邊移，胞質(zhì)中部分細(xì)胞器出現(xiàn)崩解，線粒體仍呈靜息狀態(tài)，但線粒體排列不均勻且在核周圍密集分布，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)明顯擴(kuò)張，細(xì)胞核形態(tài)明顯畸形且出現(xiàn)核溶解，染色質(zhì)在核內(nèi)呈邊集、濃縮分布。加味溫膽湯組：大鼠胃主細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，線粒體結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)明顯擴(kuò)張，胞核形態(tài)基本正常，核膜完整無(wú)固縮。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 胃主細(xì)胞超微形態(tài)結(jié)構(gòu)（×5 000）Fig.1 Ultrastructural structure of gastric primary cells（×5 000）

2.6 腸組織的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 正常組：緊密連接好，細(xì)胞形態(tài)正常。模型組：細(xì)胞崩解，損傷嚴(yán)重。加味溫膽湯組：緊密連接好，線粒體嵴稍模糊，接近正常。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 結(jié)腸黏膜超微形態(tài)結(jié)構(gòu)（×5 000）Fig.2 Ultrastructural structure of colonic mucosa（×5 000）

3 討論

3.1 加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠胃、腸動(dòng)力的影響 本實(shí)驗(yàn)采用慢性應(yīng)激配合孤養(yǎng)法誘導(dǎo)的大鼠抑郁模型，模擬了人類抑郁癥發(fā)病過(guò)程中的臨床癥狀，是當(dāng)前應(yīng)用及研究較多的抑郁癥模型[7]。造模21 d成功后給藥28 d，同樣是為更好地模擬臨床對(duì)抑郁癥的治療。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)研究動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)與探索行為的實(shí)驗(yàn)，能夠用于評(píng)價(jià)動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)以及抑郁狀態(tài)，糖水偏好實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从硠?dòng)物快感是否缺失[8]。本實(shí)驗(yàn)觀測(cè)了造模前、造模21 d后、給藥28 d后的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分和糖水偏好率，發(fā)現(xiàn)給藥28 d后加味溫膽湯組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分高于模型組，糖水偏好實(shí)驗(yàn)得分加味溫膽湯組高于模型組，說(shuō)明加味溫膽湯能夠改善抑郁模型大鼠的抑郁狀態(tài)。

國(guó)內(nèi)外研究[9-10]表明，胃腸動(dòng)力障礙在慢性身心應(yīng)激患者中普遍存在，胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙是慢性身心應(yīng)激常見(jiàn)的病理改變，表現(xiàn)為胃電節(jié)律紊亂，如胃動(dòng)過(guò)緩、胃動(dòng)過(guò)速和節(jié)律紊亂等，常見(jiàn)癥狀表現(xiàn)為消化不良、胃痛、惡心、嘔吐、噯氣、飽脹等。胃排空率和小腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)為研究胃腸功能的基本實(shí)驗(yàn)方法。

本研究對(duì)營(yíng)養(yǎng)性半固體食物的胃、小腸排空率比較結(jié)果顯示：給藥4周后，與空白組比較，模型組的胃、小腸排空率得分顯著低于空白組（P＜0.01）；與模型組比較，加味溫膽湯組的胃、小腸排空率得分增加（P＜0.05）。說(shuō)明模型組大鼠的胃、腸運(yùn)動(dòng)功能下降；加味溫膽湯組胃、腸排空率顯著升高，接近正常組，說(shuō)明加味溫膽湯具有改善抑郁模型大鼠胃、腸運(yùn)動(dòng)功能及增強(qiáng)抑郁大鼠胃、腸動(dòng)力的作用。

3.2 加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠胃、腸超微結(jié)構(gòu)的影響 長(zhǎng)期的負(fù)面情緒會(huì)導(dǎo)致胃酸超量分泌，削弱胃腸黏膜的抗病能力，胃腸黏膜細(xì)胞會(huì)因強(qiáng)烈或持續(xù)的應(yīng)激，導(dǎo)致胃黏膜上皮大量細(xì)胞不可逆的功能結(jié)構(gòu)變異和壞死，使胃黏膜形成應(yīng)激損傷。本研究觀察加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠胃、腸超微結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果提示加味溫膽湯可顯著改善抑郁模型大鼠胃、腸黏膜組織細(xì)胞的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑郁模型大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分和糖水偏好率下降，加味溫膽湯能夠提升抑郁模型大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分和糖水偏愛(ài)率，改善抑郁模型大鼠的抑郁狀態(tài)；抑郁模型大鼠出現(xiàn)了胃腸動(dòng)力異常改變，加味溫膽湯能夠有效調(diào)節(jié)抑郁模型大鼠胃腸動(dòng)力；抑郁大鼠出現(xiàn)了胃、腸組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變，加味溫膽湯能夠減輕抑郁模型大鼠的胃、腸組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損害。