肺閉寧顆粒止咳、抗炎及促進(jìn)PM2.5顆粒物排出作用的研究*

李 昂，高一平，孫燕燕，陳宇洲

（1.天津市兒童醫(yī)院，天津 300134；2.天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院，天津 300100；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

肺閉寧顆粒是以天津市兒童醫(yī)院名老中醫(yī)的經(jīng)驗處方為基礎(chǔ)，經(jīng)工藝改良后制成的醫(yī)院制劑（津藥制字Z20070308），由黃芩、枳殼、麻黃、川貝母、桔梗、人參等中藥組成，具有宣肺解熱、化痰定喘之功效，具有多年的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。

兒童的呼吸道免疫功能較差，且呼吸道纖毛運(yùn)動比較差，不能有效地清除塵埃和異物，因此兒童更容易患呼吸道感染。隨著季節(jié)變遷、大氣污染的加重，兒童呼吸道感染的機(jī)會大大增多。尤其是近年來，受霧霾天氣影響，據(jù)統(tǒng)計兒科門診中兒童呼吸道感染占39%～65%，兒科住院部肺炎患病率最高，約占25%～65%，因此兒童呼吸系統(tǒng)疾病一直以來都備受業(yè)內(nèi)人士的關(guān)注。

本研究采用二氧化硫引咳小鼠模型、內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺損傷小鼠模型以及斑馬魚PM2.5超細(xì)顆粒物排出模型，在給予不同濃度的肺閉寧顆粒干預(yù)后，觀察其止咳、抗炎以及對納米顆粒從斑馬魚體內(nèi)排出進(jìn)入腸道的影響，觀察肺閉寧顆粒止咳、抗炎及對抗PM2.5損傷方面的作用，評價其在對抗霧霾天氣引起的呼吸道系統(tǒng)疾病治療中的潛力，為其臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與主要試劑 解剖顯微鏡（SMZ645，Nikon公司）、6孔板（Nest Biotech）、精密電子天平（CP214，奧豪斯）、顯微注射儀（IM-300，Narishige）、拉針儀（PC-10，Narishige，Japan）。納米活性炭（ACNP，粒徑200 nm，軍事醫(yī)學(xué)院科學(xué)院毒物藥物研究所）；脂多糖（LPS，Sigma，貨號：L2880）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，碧云天，貨號：C0221A）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測試劑盒（R&D，貨號：VAL604）。

1.2 實驗動物 ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量16～18 g，購于北京維通利華公司，動物合格證號：11400 700211245。黑色素等位基因突變型（Albino）品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進(jìn)行。年齡為受精后2 d，共150尾。

1.3 受試藥物 1）肺閉寧顆粒：天津市兒童醫(yī)院，批號：20160501；2）急支糖漿：太極集團(tuán)涪陵制藥廠，批號：15100924；3）雙黃連注射劑：河南福森藥業(yè)有限公司，批號：1606062。

2 實驗方法

2.1 對二氧化硫引咳小鼠模型的改善作用

2.1.1 二氧化硫氣體的制備 用250 mL的側(cè)口燒瓶，側(cè)口用橡皮管連接球膽，瓶內(nèi)放亞硫酸鈉。燒瓶塞上裝1個分液漏斗，內(nèi)放濃硫酸。打開分液漏斗的活塞，濃硫酸滴下后在瓶內(nèi)產(chǎn)生二氧化硫氣體，儲存于球膽內(nèi)備用[1]。

2.1.2 分組給藥及模型制備 ICR小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量16～18g，隨機(jī)分成5組，分別為對照組、急支糖漿組（4.5 mL/kg）、肺閉寧顆粒低（1.85 g/kg）、中（3.69 g/kg）、高（7.38 g/kg）劑量組。分別按劑量灌服藥液，對照組灌服等量飲用水，每日1次，連續(xù)灌服3 d。末次給藥1 h后，將小鼠放入密封的鐘罩內(nèi)（5 000 mL），注入20 mL二氧化硫氣體。立刻計時，刺激3 min，記錄小鼠開始咳嗽的時間為咳嗽潛伏期。取出小鼠放入大燒杯內(nèi)，繼續(xù)觀察20 min，并記錄 0～10 min、10～20 min 小鼠的咳嗽次數(shù)[1]。

2.2 對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠肺損傷的保護(hù)作用 ICR小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量16～18 g，隨機(jī)分成6組，即對照組、模型組、雙黃連組、肺閉寧顆粒低（1.85 g/kg）、中（3.69 g/kg）、高（7.38 g/kg）劑量組。除對照組、模型組給予等量飲用水外，其他各組均灌胃給與相應(yīng)藥物。每日1次、連續(xù)灌服3 d。末次給藥后1 h，用4%的水合氯醛、0.01 mL/g對小鼠進(jìn)行腹腔注射。除對照組外，其他各組在聚光燈下拉出小鼠的舌根（用0.9%氯化鈉溶液浸潤的紗布包繞小鼠舌尖輕輕將其拉出，避免對小鼠的損傷）以暴露聲門，直視下將22 G穿刺套管針輕推進(jìn)入氣管，隨即用1 mL的注射器向氣管內(nèi)快速注入l g/L的LPS 50 μL，緊接讓小鼠置于垂直于地面的位置，并旋轉(zhuǎn)0.5～1 min，使LPS均勻地分布在肺內(nèi)。對照組氣管內(nèi)注入50 μL PBS。造模24 h后，每組的8只小鼠用總體積1.8 mL預(yù)冷的PBS等分3次進(jìn)行肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液樣品離心（3 000 r/min，4℃）10 min，進(jìn)行相關(guān)炎癥因子IL-6的測定；其余8只小鼠取肺稱取質(zhì)量，在60℃的烘箱中干燥48 h，進(jìn)行肺組織濕干重（W/D）比率、肺指數(shù)的測定[2-4]。

2.3 對斑馬魚PM2.5超細(xì)顆粒物排出模型改善作用 隨機(jī)選取150尾受精后2 d（2 dpf）黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，分成5組，即正常組（不注射活性炭納米顆粒）、模型組、肺閉寧顆粒低、中、高劑量組。將2.3 mg/mL納米活性炭作為PM2.5納米顆粒，注射到2 dpf斑馬魚卵黃囊中（相當(dāng)于人肌肉注射），每尾斑馬魚注射30 nL，即以69 ng/尾劑量建立斑馬魚PM2.5排出模型。每孔均處理30尾斑馬魚，肺閉寧低、中、高劑量組分別水溶給予13.9、41.7和125 mg/mL濃度的肺閉寧顆粒，并且每日更換藥液，正常組和模型對照組只換養(yǎng)魚水。藥物處理6 d后，統(tǒng)計體內(nèi)納米活性炭排出進(jìn)入腸道的斑馬魚數(shù)量[Z（納米顆粒排出進(jìn)入腸道）]，與該組斑馬魚總數(shù)[Z（總數(shù)）]求得比值，計算排出發(fā)生率[5]。納米活性炭排出發(fā)生率計算公式：

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組獨(dú)立樣本均數(shù)比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 對二氧化硫引咳小鼠模型的改善作用 實驗結(jié)果顯示，急支糖漿組與肺閉寧顆粒高劑量組可以延長二氧化硫引咳小鼠咳嗽潛伏期，與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明該藥有較好的止咳作用。急支糖漿組與高、中劑量的肺閉寧顆粒可不同程度減少各時間段小鼠的咳喊次數(shù)，與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），并且呈一定的量效關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 肺閉寧顆粒對二氧化硫引咳小鼠模型的改善作用(x±s)Tab.1 Improvement of Feibining Granules on sulphur dioxide cough model mice(x±s)

3.2 對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠肺損傷的保護(hù)作用 小鼠LPS染毒24 h后，聚堆并且懶于活動，抓取時逃避無力，ELISA實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠肺泡灌洗液中IL-6的生成水平顯著高于對照組，說明造模成功。與模型組比較，雙黃連組、肺閉寧顆粒中、高劑量組可降低IL-6濃度（P＜0.05），具有一定的抗炎效果，在肺指數(shù)及肺組織W/D比率方面沒有明顯的改善效果。見表2。

表2 肺閉寧顆粒對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠肺損傷的保護(hù)作用(x±s)Tab.2 Protective effects of Feibining Granules on endotoxin-induced lung injury model mice(x±s)

3.3 對斑馬魚PM2.5超細(xì)顆粒物排出模型改善作用 實驗結(jié)果顯示：肺閉寧顆粒125 mg/mL時，納米活性炭排出發(fā)生率為63.3%，與模型組（16.7%）比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），顯示肺閉寧顆粒在125 mg/mL濃度時對斑馬魚納米活性炭排出進(jìn)入腸道有明顯的促進(jìn)作用。見表3和圖1。

表3 各組斑馬魚體內(nèi)納米活性炭排出發(fā)生率Tab.3 Secretion of nano-activated carbon on zebrafish model

圖1 各組斑馬魚腸道排出納米活性炭表型圖Fig.1 Secretion of nano-activated carbon on zebrafish model

曲線所圈范圍為斑馬魚腸道；模型組、肺閉寧顆粒低、中劑量組圖中箭頭所指為腸道外的納米活性炭，肺閉寧顆粒高劑量組圖中箭頭所指為腸道內(nèi)的納米活性炭

4 討論

霧霾污染是非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，是嚴(yán)重危害人類健康的大氣環(huán)境污染，困擾著中國大部分城市和地區(qū)。其中細(xì)顆粒物（特別是PM2.5）是對人體健康造成嚴(yán)重威脅的重要致病物質(zhì)。尤其對于兒童，國內(nèi)外的長期跟蹤研究發(fā)現(xiàn)，短期暴露于高PM2.5的環(huán)境中，將會導(dǎo)致兒童肺功能的改變及哮喘的發(fā)病率增加，而長期暴露將會誘發(fā)兒童的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，與由呼吸系統(tǒng)疾病所導(dǎo)致的新生兒后期病死率相關(guān)。目前預(yù)防霧霾的措施主要是利用防霧霾口罩來減少細(xì)顆粒霧的吸入，從而達(dá)到降低霧霾危害的目的。在此基礎(chǔ)上，促進(jìn)已吸入體內(nèi)的PM2.5排出，將對預(yù)防和降低霧霾天氣對人機(jī)體造成的損傷具有重大的臨床意義。

肺閉寧顆粒源于臨床經(jīng)方，具有宣肺解熱、化痰定喘功效。主治哮喘性支氣管炎、支氣管肺炎，在臨床上有多年的應(yīng)用基礎(chǔ)，深受廣大患者的認(rèn)可。在劑量選擇上，按照肺閉寧顆粒說明書所示，3歲以上兒童每日用量9 g，通過使用等效劑量換算系數(shù)進(jìn)行折算作為實驗動物高劑量組的給藥依據(jù)，并逐級建立了中、低劑量組。本研究采用二氧化硫引咳小鼠模型、內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺損傷小鼠的經(jīng)典模型進(jìn)行研究，肺閉寧顆粒為天津市兒童醫(yī)院經(jīng)典中藥復(fù)方制劑，相比于西藥，在臨床應(yīng)用中具有多途徑、多靶點的特點。本研究選擇了有大量文獻(xiàn)報道[6-7]、已經(jīng)在臨床中取得了良好治療效果的中藥復(fù)方制劑（急支糖漿和雙黃連注射液）作為陽性對照藥。

本研究除應(yīng)用了經(jīng)典的止咳及抗炎模型，還采用了較為新穎的斑馬魚PM2.5超細(xì)顆粒物排出模型對肺閉寧顆粒進(jìn)行藥效學(xué)評價。斑馬魚作為模型動物，具有與人類基因同源性高（80%以上）、高通量、快速、費(fèi)用低等特點，近年來廣泛用于藥物藥效作用的篩選及早期毒性篩選研究中。由于PM2.5超細(xì)顆粒物的尺寸和成分復(fù)雜，直接使用大氣中收集的超細(xì)顆粒物進(jìn)行研究較為困難，因此研究者多采用納米顆粒代替PM2.5超細(xì)顆粒物進(jìn)行研究[8]。很多研究通過跟蹤納米顆粒的體內(nèi)代謝過程，發(fā)現(xiàn)納米顆粒除了可以通過從肺部[9]、肝臟[10]等部位清除外，還可通過腸道排出體外[11]。Zhao等[12]的研究進(jìn)一步證明了進(jìn)入斑馬魚和小鼠體內(nèi)的納米活性炭顆粒都能通過腸道的杯狀細(xì)胞分泌代謝進(jìn)入腸道而排出，被稱為腸杯狀細(xì)胞分泌通路（IGCSP）。由于斑馬魚胚胎透明易于直接觀察，本研究利用IGCSP，設(shè)計了對斑馬魚卵黃囊內(nèi)注射納米活性炭顆粒制備斑馬魚PM2.5超細(xì)顆粒物排出模型，評價肺閉寧顆粒對體內(nèi)PM2.5超細(xì)顆粒物排出的影響。

本實驗結(jié)果顯示肺閉寧顆粒可明顯減少二氧化硫引咳模型小鼠咳嗽潛伏期時間及咳嗽次數(shù)，可降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺損傷小鼠肺灌流液中IL-6濃度，促進(jìn)斑馬魚模型PM2.5超細(xì)顆粒物排出。提示其在對抗霧霾天氣引起的呼吸道系統(tǒng)疾病治療中，在減少PM2.5對人機(jī)體損傷方面具有一定的效果，為其臨床應(yīng)用提供了實驗數(shù)據(jù)支持。