青蒿琥酯通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化酶活性抑制PC12細(xì)胞氧化損傷

沈先敏，劉 恒

（襄陽(yáng)市中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽(yáng) 441021）

隨著全球人口老齡化的加重，帕金森病、阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高。研究認(rèn)為，線(xiàn)粒體功能障礙[1]、細(xì)胞凋亡[2]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[3]、氧化損傷[4-5]均介導(dǎo)了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，然而，其中氧化應(yīng)激在該類(lèi)疾病發(fā)生中關(guān)系最為密切?；钚匝酰≧OS）為引起細(xì)胞內(nèi)氧化損傷的主要因素之一，包含超氧離子、羥自由基等[6]。ROS可通過(guò)氧化損傷脫氧核糖核酸（DNA）、膜脂及蛋白質(zhì)多種生物分子，引起細(xì)胞功能異常；而過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）等抗氧化酶可以清除氧自由基，起到保護(hù)細(xì)胞氧化損傷的作用[7-8]。青蒿琥酯與青蒿素一樣對(duì)瘧疾的治療效果較顯著，而且還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化應(yīng)激的作用[9]。因此，本研究利用過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞系PC12細(xì)胞氧化損傷模型，檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用并初步分析其作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤 PC12細(xì)胞由上海名勁生物科技有限公司提供（來(lái)源于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）。

1.2 試劑及儀器 青蒿琥酯（百靈威科技有限公司，批號(hào)：88495-63-0，≥98%），達(dá)爾伯克改良伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基及胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司（批號(hào)：R001100），CCK8試劑盒購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司（批號(hào)：CK04），H2O2溶液（分析純）購(gòu)自北京斯百匯生物科技有限責(zé)任公司，乳酸脫氫酶（LDH）、SOD、丙二醛（MDA）、CAT、GSH-PX 測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物有限公司，2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。BIORAD-550型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)公司），BBS-V800型單人超凈臺(tái)（山東鑫貝西公司），SPX-250型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），IN Cell Analyzer 2000高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)TFS公司。

1.3 PC12細(xì)胞培養(yǎng) 采用完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2濃度，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至95%左右時(shí)用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗后加入胰酶消化，顯微鏡下觀察待細(xì)胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，分裝于3個(gè)培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 青蒿琥酯對(duì)PC12細(xì)胞相對(duì)存活率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化、離心、重懸后，以每毫升1×105個(gè)的細(xì)胞濃度接種于96孔板，每孔加入200 μL的細(xì)胞懸液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)過(guò)夜待細(xì)胞貼壁后，每孔加入200 μL青蒿琥酯溶液，使其終濃度分別為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去舊培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK8試劑，孵育1 h后采用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，細(xì)胞相對(duì)存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。

1.5 CCK8法檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù) 按照“1.4”項(xiàng)下接種細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為6組：正常對(duì)照組、H2O2（200 μmol/L）誘導(dǎo)組、青蒿琥酯保護(hù)組（0.2、0.4、0.8、1.2 mmol/L），首先在保護(hù)組中加入相應(yīng)濃度青蒿琥酯溶液，2 h后再加入H2O2。培養(yǎng)24 h，吸去舊培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK8試劑，孵育1 h后采用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

1.6 LDH法檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化、離心、重懸后，以每毫升1×106個(gè)的細(xì)胞濃度接種于6孔板，每孔加入2 mL的細(xì)胞懸液。按照“1.5”項(xiàng)分組處理細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞上清用于LDH含量測(cè)定，其操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 PC12細(xì)胞內(nèi)ROS及MDA水平檢測(cè) 按對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每毫升1×105個(gè)濃度接種于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的96孔板中，細(xì)胞分為正常對(duì)照組、H2O2（200 μmol/L）誘導(dǎo)組、青蒿琥酯保護(hù)組（0.2、0.4、0.8、1.2 mmol/L），細(xì)胞經(jīng)上述處理 24 h 后除去舊培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS清洗3次，加入1 mg/L的Hoechst33342避光染色30 min后，再加入10 μmol/L的DCFH-DA溶液繼續(xù)染色30 min。經(jīng)PBS清洗3次后，采用高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)在激發(fā)光為485 nm和發(fā)射光為525 nm的條件下檢測(cè)熒光值。另按“1.6”項(xiàng)培養(yǎng)并處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞超聲破碎后按照MDA試劑盒步驟在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，并計(jì)算含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 PC12細(xì)胞中SOD、CAT及GSH-PX活力測(cè)定按“1.6”項(xiàng)培養(yǎng)并處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞超聲破碎后離心，吸取上清分別在550、240、412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定SOD、CAT及GSH-PX的OD值，并計(jì)算活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度青蒿琥酯對(duì)PC12細(xì)胞相對(duì)存活率的影響 青蒿琥酯對(duì)PC12細(xì)胞相對(duì)存活率影響結(jié)果見(jiàn)圖1，提示青蒿琥酯在0.1～1.6 mmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)PC12細(xì)胞相對(duì)存活率沒(méi)有明顯影響，雖然細(xì)胞的相對(duì)存活率稍有變化，但與對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 青蒿琥酯對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響（n=6）Fig.1 Effects of artesunate on the vitality of PC12 cells（n=6）

2.2 CCK8法檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 結(jié)果見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比，H2O2誘導(dǎo)組PC12細(xì)胞相對(duì)存活率顯著降低（P＜0.05）；而經(jīng)過(guò)不同劑量青蒿琥酯干預(yù)后，細(xì)胞相對(duì)存活率顯著升高，與H2O2誘導(dǎo)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性。

圖2 青蒿琥酯對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞相對(duì)存活率的影響（n=6）Fig.2 Effects of artesunate on the relative survival rate of PC12 cells induced by H2O2（n=6）

2.3 青蒿琥酯對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞上清LDH水平的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3所示。對(duì)照組中LDH水平降低，而H2O2誘導(dǎo)組中LDH水平較高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)過(guò)不同濃度青蒿琥酯干預(yù)后，上清中LDH水平隨著劑量升高而明顯降低，與H2O2誘導(dǎo)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 青蒿琥酯對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞上清LDH含量的影響（n=6）Fig.3 Effects of artesunate on the levels of LDH in PC12 cells induced by H2O2（n=6）

2.4 青蒿琥酯對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞內(nèi)ROS及MDA水平的影響 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中ROS及MDA水平變化見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，H2O2誘導(dǎo)組中ROS的相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFU）及MDA水平顯著升高（P＜0.05）；與 H2O2誘導(dǎo)組比較，經(jīng)不同劑量青蒿琥酯干預(yù)后，PC12細(xì)胞內(nèi)ROS及MDA水平均隨著藥物濃度升高而降低（P＜0.05）。

表1 不同組間ROS及MDA水平比較(x±s)Tab.1 Comparison of the levels of ROS and MDA in different groups(x±s)

2.5 青蒿琥酯對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT及GSHPX活力的影響 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中SOD、CAT及GSH-PX活力變化見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，H2O2誘導(dǎo)組中SOD、CAT及GSH-PX活力降低（P＜0.05）；與H2O2誘導(dǎo)組比較，經(jīng)不同劑量青蒿琥酯干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT及GSH-PX活力均隨著藥物濃度升高而上升（P＜0.05）。

3 討論

早前研究報(bào)道青蒿琥酯能夠改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后模型大鼠早期腦損傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin和緊密連接蛋白-1（ZO-1）的表達(dá)相關(guān)[10]，而且青蒿琥酯能促使視網(wǎng)膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制與激活PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)[11]，還發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能抑制脂多糖誘導(dǎo)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系（BV-2細(xì)胞）炎性反應(yīng)[12]。相關(guān)報(bào)道證實(shí)青蒿琥酯可明顯降低人結(jié)腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，其作用機(jī)制可能與抑制Jak2/Stat3信號(hào)通路的激活相關(guān)[13]，本研究探討了青蒿琥酯對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，初步研究了青蒿琥酯保護(hù)PC12細(xì)胞免受氧化損傷的效果與機(jī)制。

表2 不同組間SOD、CAT及GSH-PX活力的比較(x±s)Tab.2 Comparison of the activity of SOD，CAT and GSHPX in different groups(x±s)kU/g protein

藥物毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯在0.1～1.6 mmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)PC12細(xì)胞的相對(duì)存活率沒(méi)有明顯影響，說(shuō)明所選濃度的藥物對(duì)PC12細(xì)胞的相對(duì)存活率沒(méi)有影響。進(jìn)一步研究不同濃度青蒿琥酯對(duì)PC12細(xì)胞免受H2O2損傷的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該藥物能顯著增加PC12細(xì)胞的相對(duì)存活率，并且表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，胞內(nèi)LDH會(huì)釋放到培養(yǎng)液中，LDH水平能夠直接反映細(xì)胞凋亡的狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2誘導(dǎo)組中細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量顯著升高，然而經(jīng)過(guò)不同濃度青蒿琥酯干預(yù)細(xì)胞后LDH含量明顯降低，且表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。ROS可以使細(xì)胞膜上的脂質(zhì)類(lèi)物質(zhì)氧化，產(chǎn)生MDA引發(fā)細(xì)胞氧化損傷或凋亡，早期報(bào)道很多中藥成分如生物黃酮類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素等都有清除氧自由基的作用[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)H2O2誘導(dǎo)組PC12細(xì)胞內(nèi)ROS的水平明顯升高，MDA含量也相應(yīng)增加，采用不同濃度青蒿琥酯干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA含量均明顯降低，提示青蒿琥酯可以減輕H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷。SOD、CAT及GSH-PX都是內(nèi)源性的抗氧化酶，可以直接清除自由基，降低細(xì)胞的氧化損傷[17]。實(shí)驗(yàn)最后檢測(cè)了青蒿琥酯對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT及GSH-PX活性的影響，發(fā)現(xiàn)H2O2能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中抗氧化酶SOD、CAT及GSH-PX活性減弱，而青蒿琥酯則能顯著升高SOD、CAT及GSH-PX的活性，從而達(dá)到清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基、減輕氧化損傷的作用。

胞內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡在細(xì)胞增殖及生理功能中起著關(guān)鍵的作用，一旦平衡被打破便會(huì)出現(xiàn)ROS的過(guò)量產(chǎn)生，后者會(huì)誘導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路的激活，引發(fā)細(xì)胞損傷[18]。綜上所述，青蒿琥酯對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用預(yù)示著其可能對(duì)一些神經(jīng)病變性疾病有一定療效，值得后期更深入研究。