靈芝烯酸B誘導(dǎo)Oct4去SUMO化激活G0期胃癌側(cè)群細(xì)胞*

成睿珍 ，張春艷 ，劉鳳婷 ，李 睿 ，吳文靜 ，李艷霞 ，馬曉芳 ，李麗麗 ，4，劉曉智

（1.天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)科，天津 300450；2.天津醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，天津 300070；3.天津市第五中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，天津 300450；4.天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300060）

靈芝烯酸B（GAB）是一種從中草藥?kù)`芝中提取分離得到的羊毛甾烷型三萜化合物[1]。研究表明，GAB對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用，是一種頗具開發(fā)潛力的中藥有效成分[2]。但目前人類對(duì)其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制依舊知之甚少。本研究將以胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的根源——胃癌側(cè)群細(xì)胞為研究對(duì)象，選擇關(guān)鍵的干性維持蛋白八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（Oct4）為靶點(diǎn)，從類泛素化修飾角度分析GAB對(duì)胃癌側(cè)群細(xì)胞的影響與潛在的分子機(jī)制，擬針對(duì)當(dāng)前臨床胃癌患者對(duì)常規(guī)化療藥物順鉑耐藥性的問題展開研究，為未來(lái)基于GAB的中草藥研發(fā)和腫瘤治療方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.2 試劑 GAB標(biāo)準(zhǔn)品（青島捷世康生物科技有限公司）、順鉑（山東齊魯制藥）；胎牛血清、達(dá)爾伯克改良伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基、腫瘤干細(xì)胞專用培養(yǎng)基（美國(guó) Gibco公司）；免疫磁珠（CD133+）細(xì)胞分選試劑盒（德國(guó)Miltenyi Biotec公司）；兔抗人CD133抗體（美國(guó)Chemicon公司）、小鼠抗人小泛素樣修飾蛋白（SUMO）-1抗體、兔抗人Oct4、Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin A2和 Cyclin B1抗體（美國(guó)Abcam公司）；四甲基噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒（北京鼎國(guó)公司）。

1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司）、酶聯(lián)免疫分析儀（BioTek），流式細(xì)胞周期檢測(cè)由國(guó)家納米技術(shù)與工程研究院完成。

2 方法

2.1 胃癌側(cè)群細(xì)胞分離與培養(yǎng) 常規(guī)胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901胃癌細(xì)胞，充分重懸至單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞終濃度為5×106個(gè)/mL，先后加入CD133抗體（終濃度為20 μg/mL）及二抗包被的超微磁珠，輕柔混勻后室溫孵育20 min，利用磁場(chǎng)及分離柱裝置分離得到CD133+和CD133-胃癌側(cè)群細(xì)胞。將CD133+胃癌側(cè)群細(xì)胞接種于96孔板中，使每孔僅含1個(gè)細(xì)胞，于含5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 取直徑接近100 μm的胃癌側(cè)群細(xì)胞克隆球，對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：1）對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞96 h；2）GAB組：加入終濃度為10 μmol/L的GAB，持續(xù)作用96 h。每隔24 h于倒置顯微鏡下測(cè)量10個(gè)細(xì)胞克隆球直徑，繪制克隆球直徑變化曲線。

2.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 取對(duì)照組及GAB組胃癌側(cè)群細(xì)胞分別經(jīng)胰酶消化得單細(xì)胞懸液，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗后以70%乙醇4℃冰箱內(nèi)固定過(guò)夜，碘化丙啶（PI）染色30 min，行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，CELL Quest軟件采樣分析結(jié)果，以公式PIx=（S+G2M）/（G0G1+S+G2M）計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。

2.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）方法檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取對(duì)照組及GAB組胃癌側(cè)群細(xì)胞總蛋白，以10%分離膠進(jìn)行電泳，冰浴下110 V轉(zhuǎn)膜60 min，室溫下脫脂奶粉抗原封閉60 min，然后分別加入Oct4（1∶1000）、SUMO-1（1∶2000）、CyclinD1（1∶1000）、Cyclin E1（1∶2 000）、Cyclin A2（1∶5 000）和 Cyclin B1（1∶2 000）抗體，4℃水平搖床孵育過(guò)夜。次日使用二抗（1∶2 000）孵育60 min后用超信號(hào)蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)，凝膠成像系統(tǒng)掃描光密度值，QuantityOne軟件進(jìn)行定量分析。以β-actin為內(nèi)參。

2.5 MTT實(shí)驗(yàn) 按上述實(shí)驗(yàn)分組在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度分別為 0.4、2、10、50 和 250 μg/mL 的順鉑，作用48 h后行MTT實(shí)驗(yàn)，于酶聯(lián)免疫分析儀上分別測(cè)定其吸光度值（λ=490 nm），根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算順鉑對(duì)胃癌側(cè)群細(xì)胞的半數(shù)致死量IC50；設(shè)置空白對(duì)照組，3個(gè)平行孔。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 克隆球生長(zhǎng)曲線 自GAB藥物處理24 h開始后的4個(gè)不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，GAB組CD133+胃癌側(cè)群細(xì)胞克隆球直徑均明顯小于對(duì)照組，兩者間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見圖 1。

3.2 細(xì)胞周期分布情況 對(duì)照組CD133+胃癌側(cè)群細(xì)胞處于 G0/G1期的比例為（61.49±4.56）%，其細(xì)胞增殖指數(shù) PIx=（38.51±5.06）%；GAB 組 CD133+胃癌側(cè)群細(xì)胞處于G0/G1期的比例為（43.54±4.09）%，其細(xì)胞增殖指數(shù)PIx=（56.46±3.87）%，與對(duì)照組相比，GAB組的細(xì)胞增殖指數(shù)具有明顯差異（P＜0.01），見圖 2。

圖1 CD133+胃癌側(cè)群細(xì)胞克隆球直徑生長(zhǎng)曲線Fig.1 Clonal growth curve of CD133+gastric cancer side population cells in different groups

圖2 不同處理組CD133+胃癌側(cè)群細(xì)胞周期分布比較Fig.2 Cell cycle distribution of CD133+gastric cancer side population cells in different groups

3.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，GAB組胃癌側(cè)群細(xì)胞的Oct4、SUMO-1和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著降低，而Cyclin E1、Cyclin A2和Cyclin B1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖3。

3.4GAB對(duì)胃癌側(cè)群細(xì)胞順鉑IC50的影響 對(duì)照組CD133+胃癌側(cè)群細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50為29.65μg/mL，GAB組CD133+胃癌側(cè)群細(xì)胞對(duì)順鉑的 IC50為87.64 μg/mL，在順鉑濃度為 10 μg/mL 及 50 μg/mL作用下，兩組間IC50比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見圖4。

4 討論

胃癌的癌變是個(gè)多因素、多步驟、多階段的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，涉及遺傳、環(huán)境、心理等多個(gè)方面[3]。腫瘤細(xì)胞中存在一群具有無(wú)限增殖潛能的類干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞亞群，被稱為腫瘤側(cè)群細(xì)胞。這些細(xì)胞常處于休眠狀態(tài)，即細(xì)胞周期G0期，恰好能夠逃避當(dāng)前以靶向細(xì)胞增殖周期S期及G2/M期的常規(guī)放、化療手段[4-5]。因此，理論上，靶向胃癌側(cè)群細(xì)胞的治療能夠起到事半功倍的效果。

圖3 Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理組蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.3 Protein expression detected by Western Blot in different groups

圖4MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GAB對(duì)不同組細(xì)胞增殖抑制率的比較Fig.4 Comparison with inhibition rates of cell proliferation in GAB groups by MTT assay

靈芝為中國(guó)傳統(tǒng)中藥，味甘性平，歸心、肝、肺腎經(jīng)。具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘、扶正固本之功效[6]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，靈芝及其有效成分具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗氧化清除自由基、保護(hù)肝臟等作用[7]。GAB是從靈芝中提取得到的一種羊毛甾烷型三萜化合物。研究表明，GAB對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用[8]。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，GAB能夠通過(guò)逆轉(zhuǎn)腫瘤側(cè)群細(xì)胞中ATP結(jié)合盒子家族G成員-2的多藥耐藥活性，進(jìn)而提高肝癌側(cè)群細(xì)胞對(duì)化療藥物的治療敏感性。

基于上述發(fā)現(xiàn)，筆者推測(cè)GAB也能夠提高胃癌側(cè)群細(xì)胞對(duì)化療藥物的治療敏感性，但是目前幾乎未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究首次以胃癌側(cè)群細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察GAB對(duì)其生長(zhǎng)抑制效果，并從干性維持核心蛋白Oct4的類泛素化修飾角度解讀GAB增加胃癌側(cè)群細(xì)胞化療敏感性的內(nèi)在機(jī)制，以期為未來(lái)靶向胃癌側(cè)群細(xì)胞的中草藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考和借鑒。

本研究以具有腫瘤干細(xì)胞特征的CD133+的SGC-7901胃癌側(cè)群細(xì)胞為研究對(duì)象[10]。首先利用流式細(xì)胞術(shù)分選得到該類細(xì)胞，并GAB處理96 h。通過(guò)繪制克隆球直徑變化曲線發(fā)現(xiàn)，GAB能夠明顯抑制胃癌側(cè)群細(xì)胞克隆球的生長(zhǎng)，進(jìn)一步的流式細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，GAB能夠誘導(dǎo)胃癌側(cè)群細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)相由G0/G1期向G2/M期發(fā)生偏移。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論，本研究檢測(cè)了不同細(xì)胞周期時(shí)相的標(biāo)記蛋白Cyclins的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，G0/G1期早期標(biāo)志蛋白Cyclin D1的蛋白水平在正常胃癌側(cè)群細(xì)胞中高表達(dá)，但在GAB處理后該蛋白表達(dá)水平明顯下降，與此同時(shí)，G1/S過(guò)渡期標(biāo)志蛋白Cyclin E1，G2期標(biāo)志蛋白Cycin A2以及G2/M過(guò)渡期標(biāo)志蛋白Cyclin B1的蛋白水平均明顯升高。提示，GAB能夠顯著誘導(dǎo)胃癌側(cè)群細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)相發(fā)生后移。為進(jìn)一步了解GAB誘導(dǎo)發(fā)生的細(xì)胞周期時(shí)相后移是否能夠提高胃癌側(cè)群細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的敏感性，本研究檢測(cè)了順鉑對(duì)CD133+胃癌側(cè)群細(xì)胞的IC50，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAB處理能夠使順鉑對(duì)胃癌側(cè)群細(xì)胞 IC50從 69.84 μg/mL下降至35.67 μg/mL。該結(jié)果表明，GAB的確可以通過(guò)誘導(dǎo)胃癌側(cè)群細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)相后移，使其自身暴露于化療藥物順鉑的殺傷范圍，進(jìn)而增加化療敏感性。

蛋白質(zhì)類泛素化修飾是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類參與蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定、核漿移位、拮抗泛素水解等多種功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式[11]。Wei等[12]報(bào)道維持細(xì)胞干性功能的核心Oct4為SUMO-1的調(diào)節(jié)靶蛋白之一。Oct4蛋白上特定賴氨酸位點(diǎn)被SUMO結(jié)合修飾后可使其自身的蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，避免被泛素介導(dǎo)的蛋白水解酶降解，進(jìn)而維持在較高的水平，參與干細(xì)胞干性維持。基于上述分析，本研究推測(cè)Oct4的SUMO化修飾調(diào)節(jié)機(jī)制可能參與了GAB誘導(dǎo)的胃癌側(cè)群細(xì)胞周期時(shí)相后移過(guò)程，因此該研究也檢測(cè)了SUMO-1和Oct4的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明GAB的確能夠誘導(dǎo)Oct4蛋白的去SUMO化修飾，進(jìn)而促使Oct4蛋白降解，最終降低胃癌側(cè)群細(xì)胞的干性維持能力。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)GAB能夠通過(guò)誘導(dǎo)Oct4去SUMO化修飾途徑激活G0期的胃癌側(cè)群細(xì)胞，促使其發(fā)生細(xì)胞周期時(shí)相后移，進(jìn)而暴露于常規(guī)化療藥物順鉑的作用區(qū)間，實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌側(cè)群細(xì)胞化療增敏效果。該研究為未來(lái)基于GAB的中草藥研發(fā)及胃癌側(cè)群細(xì)胞的靶向治療提供了重要的參考價(jià)值和實(shí)驗(yàn)借鑒。