紫外-可見分光光度法測定止痛祛風(fēng)膠囊中總黃酮含量

龐學(xué)豐 梁國成 方建康 陳舒茵 江麗芬 陳壯 馮玉青 李玉玲 唐麗萍 黃政治 廖家瑜

【摘 要】目的：建立紫外-可見分光光度法測定止痛祛風(fēng)膠囊中總黃酮含量的方法。方法：采用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲提取總黃酮，以芒果苷為對照品，紫外-可見分光光度法測定止痛祛風(fēng)膠囊中的總黃酮含量，檢測波長380 nm。結(jié)果：芒果苷在0.001 15～0.009 2 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為86.14%，RSD為4.99%。結(jié)論：采用紫外-可見分光光度法測定止痛祛風(fēng)膠囊中總黃酮含量的方法，操作簡便，重復(fù)性好，可作為止痛祛風(fēng)膠囊總黃酮的含量測定方法。

【關(guān)鍵詞】 止痛祛風(fēng)膠囊;紫外-可見分光光度法;總黃酮;含量測定

痛風(fēng)是單鈉尿酸鹽沉積于骨關(guān)節(jié)、腎臟和皮下等部位，引發(fā)急、慢性炎癥和組織損傷，與嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關(guān)[1]，是臨床常見疾病之一。本病最常見的表現(xiàn)形式為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作。目前，西醫(yī)主要予抗炎鎮(zhèn)痛、抑制尿酸生成藥或促進(jìn)尿酸排泄藥治療，雖然有一定療效，但長期服用會產(chǎn)生很多不良反應(yīng)，患者難以堅持。目前，尚無根治藥物，研究開發(fā)新的藥物，尤其是療效肯定且不良反應(yīng)少的中藥尤為必要。

止痛祛風(fēng)湯是筆者在多年臨床實踐中總結(jié)出來的治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗方，由白芍、知母、萆薢、腫節(jié)風(fēng)、忍冬藤、葫蘆茶、兩面針、葛根、桂枝、土茯苓、甘草等藥物組成，具有清熱解毒、活血、祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛之功效，臨床應(yīng)用及實驗研究表明具有確切的療效[2-4]。將其制備成膠囊劑，能掩蓋藥物不良嗅味，提高藥物穩(wěn)定性，且攜帶方便。方中知母、萆薢、腫節(jié)風(fēng)、忍冬藤、葫蘆茶、葛根、土茯苓和甘草等均含總黃酮[5-7]，總黃酮是止痛祛風(fēng)膠囊的重要藥效成分之一。本研究通過提取方中有效成分，并建立含量測定的方法，為能夠直觀、有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，乃至制定產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有效依據(jù)，對整個處方的質(zhì)量監(jiān)控，保證制劑的準(zhǔn)確性及有效性，具有積極的意義。

1 實驗材料

1.1 儀 器 AL204分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;WFH-205B可見透射紫外反射儀（上海精科實業(yè)有限公司）;CQ-250 超聲波清洗機（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）;紫外-可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品 止痛祛風(fēng)膠囊（醫(yī)院自制，生產(chǎn)批號180425，180507，180524）;芒果苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號111607-201704，含量測定用）;甲醇（成都市科龍化工試劑廠，分析純）;乙醇（上海沃凱生物技術(shù)有限公司，分析純）;純化水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取5.75 mg的芒果苷，以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶解并置于50 mL容量瓶中超聲溶解，靜置冷卻至室溫;用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇定容，即制成每毫升含0.0194 5 mg對照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備 取本品止痛祛風(fēng)膠囊內(nèi)容物，精密稱取50 mg，置于50 mL容量瓶中，以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶解并稀釋至刻度線，超聲提取1 h，冷卻至室溫;用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇補足至刻度，搖勻，過濾，濾去初濾液;取續(xù)濾液25 mL，置于50 mL的容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.3 檢測波長選擇 分別取對照品溶液和供試品溶液，以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液為空白試劑，進(jìn)行紫外全波長掃描[8-9]。結(jié)果顯示，芒果苷對照品溶液與供試品溶液光譜圖基本一致，且空白試劑無干擾，最終選擇檢測波長為380 nm。

2.4 線性及線性范圍的考察 精密吸取芒果苷對照品溶液1，2，4，6，8 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇稀釋到刻度，搖勻，分別取上述溶液，采用紫外-可見分光光度儀進(jìn)行測定;以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y = 54.255 x + 0.019 4（R = 0.999 4），結(jié)果表明，芒果苷在0.001 15～0.009 2 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 精密吸取止痛祛風(fēng)膠囊供試品溶液，在380 nm波長下連續(xù)測定5次，吸光度分別為0.477，0.482，0.463，0.499，0.491，其吸光度RSD = 0.55%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取止痛祛風(fēng)膠囊供試品溶液，在380 nm波長下，分別于0，1，3，6，9，12 h測定，吸光度分別為0.499，0.483，0.492，0.475，0.463，0.477，其吸光度RSD = 0.44%，表明溶液在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗 取同一批次的止痛祛風(fēng)膠囊5份，

分別按2.2項下平行制備止痛祛風(fēng)膠囊供試品溶液，并依法進(jìn)行測定，吸光度分別為0.478，0.482，0.464，0.499，0.491，吸光度RSD = 0.55%，表明樣品重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的止痛祛風(fēng)膠囊供試品5份，分別精密加入芒果苷對照品，依2.2項下制備供試品溶液，依法測定其中總黃酮含量，計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定 取不同3個批次的止痛祛風(fēng)膠囊，分別按2.2項下平行制備止痛祛風(fēng)膠囊供試品溶液，并依法測定批號為180425，180507，180524的樣品，對應(yīng)的總黃酮含量分別為0.037，0.036，0.035 mg·mg-1。

3 討 論

3.1 紫外-可見分光光度法 此法以分子吸收光譜為基礎(chǔ)，利用多數(shù)化合物的分子在200～800 nm光譜范圍具有紫外吸收的特點進(jìn)行分析和測定，或經(jīng)顯色后產(chǎn)生紫外吸收而測定[10]，具有設(shè)備簡單、適用性廣、準(zhǔn)確度和精密度好等優(yōu)點，已在中藥含量測定如總黃酮含量分析中廣泛應(yīng)用，且發(fā)揮著越來越重要的作用。

3.2 關(guān)于提取溶劑的選擇 中藥有效成分提取工藝條件的篩選，評價指標(biāo)的選擇十分關(guān)鍵。本次實驗對提取工藝進(jìn)行單因素預(yù)篩選，比較甲醇和體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%的乙醇的提取工藝，采用超聲提取1 h，取樣處理后測定總黃酮含量，結(jié)果體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇和體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇總黃酮提取率相對較差，分別為0.029 mg·mg-1和0.033 mg·mg-1，而甲醇和體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇提取的總黃酮相對較好，且差別不是很大，分別為0.037 mg·mg-1和0.036 mg·mg-1;但考慮到甲醇具有一定的毒性，且止痛祛風(fēng)膠囊用于口服，故選擇體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為本品研究的提取溶劑。此外，對回流提取法和超聲提取法進(jìn)行研究比較，結(jié)果表明，兩者提取總黃酮的含量差異不大，由于回流提取所需時間較久，且操作較為麻煩，最終選定超聲提取法，超聲提取1 h，處方中的總黃酮含量不再增加，因此選定用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲提取1 h。

3.3 關(guān)于紫外測定總黃酮含量測定方法研究 黃酮類化合物作為止痛祛風(fēng)膠囊的主要活性成分之一，具有降脂、抗血栓、抗氧化、降糖等多種生理活性[11]，是止痛祛風(fēng)膠囊治療痛風(fēng)的主要作用機制。其結(jié)構(gòu)以2-苯基色原酮為母核的衍生物。紫外吸收光譜由兩個主要吸收帶組成，出現(xiàn)在300～400 nm的吸收帶稱為帶Ⅰ，是由B環(huán)桂皮醛系統(tǒng)的電子躍遷所產(chǎn)生的吸收;出現(xiàn)在240～280 nm的吸收帶稱為帶Ⅱ，由A環(huán)苯甲?；到y(tǒng)的電子躍遷而產(chǎn)生吸收[10]。在研究總黃酮的含量測定方法時，筆者進(jìn)行了全波長掃描，選用芒果苷為對照品，發(fā)現(xiàn)芒果苷對照品與止痛祛風(fēng)膠囊總黃酮在波長200～500 nm可見紫外吸收光譜圖基本呈一致，且在波長380 nm處附近無太大的干擾，所以選定380 nm的條件為紫外檢測波長。

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收稿日期：2018-07-24;修回日期：2018-11-01