跳骨片調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路延緩骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變的機制研究

何曉娟 鄭文偉 賈良良 李慧 許麗梅 曾建偉 許惠鳳 鄭春松 葉錦霞 吳廣文 李西海 葉蕻芝

【摘 要】目的：探討跳骨片調(diào)控Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路保護骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的機制。方法：將30只2月齡雄性SD大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、跳骨片組，每組10只。采用改良Hulth法建立骨關(guān)節(jié)炎動物模型。造模成功后跳骨片組給予跳骨片0.32 g·kg-1·d-1灌胃，空白對照組和模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，干預(yù)12周后取大鼠關(guān)節(jié)軟骨。Real-time PCR檢測關(guān)節(jié)軟骨β-catenin、Frizzled-2、GSK-3β、CKIε mRNA表達，Western blot法檢測關(guān)節(jié)軟骨CKIε、CollagenⅡ、PGS1蛋白表達，Massion染色法觀察3組關(guān)節(jié)軟骨膠原的表達及形態(tài)變化。結(jié)果：Real-time PCR結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組關(guān)節(jié)軟骨β-catenin、Frizzled-2、CKIε mRNA表達明顯上升（P < 0.05，P > 0.05，P < 0.05），而GSK-3βmRNA表達明顯下降（P < 0.05）;與模型對照組比較，跳骨片組關(guān)節(jié)軟骨β-catenin、Frizzled-2、CKIε mRNA表達明顯下降（P < 0.05，P > 0.05，P < 0.05），而GSK-3β mRNA表達明顯上升（P < 0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組關(guān)節(jié)軟骨CKIε蛋白表達明顯升高（P < 0.05），而CollagenⅡ、PGS1蛋白表達明顯降低（P < 0.05，P < 0.01）;與模型對照組比較，跳骨片組關(guān)節(jié)軟骨CKI-ε蛋白表達明顯降低（P < 0.05），CollagenⅡ、PGS1蛋白表達明顯升高（P < 0.01，P > 0.05）。Massion染色結(jié)果顯示，空白對照組和跳骨片組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)清晰，軟骨層染色明顯，軟骨組織呈淡藍色，膠原含量較高;模型對照組軟骨層結(jié)構(gòu)紊亂，染色較淺，膠原含量低。結(jié)論：跳骨片能調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)，促進細(xì)胞外基質(zhì)的合成，保護關(guān)節(jié)軟骨。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;關(guān)節(jié)軟骨;跳骨片;Wnt/β-catenin信號通路;大鼠

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以進行性軟骨變性為特征的退行性關(guān)節(jié)病。由于成年人關(guān)節(jié)軟骨的再生能力有限，OA已成為全世界殘疾的主要原因之一[1]。OA的主要特征為軟骨細(xì)胞肥大、炎癥因子分泌增多、關(guān)節(jié)軟骨逐漸破壞，以及軟骨基質(zhì)丟失。軟骨退變是其中最為主要、嚴(yán)重的病理改變[2-3]。OA與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成分解代謝失衡密切相關(guān)，維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定對于延緩關(guān)節(jié)軟骨退變至關(guān)重要。Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和軟骨的發(fā)育、形成、修復(fù)，及軟骨的丟失有著密切聯(lián)系。β-catenin是該通路系統(tǒng)起關(guān)鍵作用的調(diào)控蛋白，它在細(xì)胞內(nèi)逐漸積聚達到一定水平會激活下游通路靶基因的表達，加速OA病情發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，跳骨片可以降低OA大鼠滑膜中炎癥因子的表達，降低OA炎癥反應(yīng)，抑制軟骨基質(zhì)降解[4]。本文通過跳骨片干預(yù)OA動物模型，觀察軟骨基質(zhì)主成分表達的變化，旨在探討跳骨片保護關(guān)節(jié)軟骨的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 2月齡雄性SPF級SD大鼠30只，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，動物合格證號SCXK（滬）2012-0002。實驗動物處置符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2 實驗試劑與儀器 跳骨片（福州屏山制藥有限公司）;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛（上海士鋒生物科技有限公司）;TBST（康為世紀(jì)有限公司）;山羊抗兔IgG/HRP（博奧森生物技術(shù)有限公司）;CKI-ε抗體（美國Santa Cruz公司）;PGS1抗體（美國Sigma公司）;β-actin抗體、CollagenⅡ抗體（美國Abcam公司）;RIPA裂解液（強）、蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）;LX-800酶標(biāo)儀（美國Bio-tek公司）;RNA濃度測定儀（美國Thermo公司）;熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

2 方 法

2.1 分組及造模方法 將30只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、跳骨片組，每組10只。模型對照組、跳骨片組采用改良Hulth法復(fù)制OA模型：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛對大鼠進行麻醉，膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口暴露關(guān)節(jié)腔，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶，切除半月板，針線對內(nèi)外皮逐層縫合[5]。術(shù)后連續(xù)3 d 20萬U青霉素肌肉注射預(yù)防感染。

2.2 給藥及取材方法 跳骨片粉碎后，用生理鹽水配成0.032 g·mL-1的混懸液。術(shù)后1周，根據(jù)人和動物藥物等效劑量換算[6]，跳骨片組大鼠給予跳骨片溶液0.32 g·kg-1·d-1灌胃，空白對照組、模型對照組給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃12周后，取關(guān)節(jié)滑膜，并用刀切取脛骨平臺及股骨髁的軟骨，-80 ℃存儲備用。

2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）

檢測關(guān)節(jié)軟骨β-catenin、Frizzled-2、GSK-3β、CKIε mRNA表達 將關(guān)節(jié)軟骨置于干凈的研缽中，加入液氮后研磨成粉末，加適量Trizol提取3組總RNA。取2 μg總RNA，按Thermo Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，按AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix試劑盒說明書進行加樣，使用ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀進行熒光收集，其中引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參基因，并用2-△△Ct值比較3組間的基因表達差異。

2.4 Western blot法檢測關(guān)節(jié)軟骨CKIε、CollagenⅡ、PGS1蛋白表達 取軟骨組織置于干凈的研缽中，加入液氮并研磨成細(xì)粉，按1 g∶4 mL加入RIPA蛋白裂解液進行冰上裂解，每30分鐘震蕩1次，2 h后吸取裂解液，離心機以14 000 r·min-1離心30 min，吸取200 μL上清液于EP管中，加入50 μL蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱變性5 min。根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果加樣，體積分?jǐn)?shù)為10%的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳2.5 h，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別孵育CKI-ε、CollagenⅡ、PGS1一抗，4 ℃過夜，TBST洗3次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h，TBST洗3次，曝光顯影。采用凝膠圖形分析軟件Image Lab對顯影后的蛋白條帶灰度值進行分析。

2.5 Masssion染色法觀察關(guān)節(jié)軟骨 常規(guī)脫蠟經(jīng)蒸餾水洗，切片經(jīng)蘇木精核染5～10 min，蒸餾水沖洗1 min，體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸乙醇分化，浸入溫水返藍數(shù)分鐘;然后將切片用麗春紅酸性品紅液處理7 min，并浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的冰醋酸中5 s;用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的磷鉬酸分化10 min，不水洗直接入苯胺藍液復(fù)染5 min;用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的冰醋酸處理5 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。3組關(guān)節(jié)軟骨Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白及基因表達水平的組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 3組關(guān)節(jié)軟骨β-catenin、Frizzled-2、GSK-3β、CKI-ε mRNA表達水平比較 與空白對照組比較，模型對照組關(guān)節(jié)軟骨中β-catenin、Frizzled-2、CKI-ε mRNA表達明顯上升（P < 0.05，P > 0.05，P < 0.05），而GSK-3β mRNA表達明顯下降（P < 0.05）;與模型對照組比較，跳骨片干預(yù)后，關(guān)節(jié)軟骨中β-catenin、Frizzled-2、CKI-ε mRNA表達明顯下降（P < 0.05，P > 0.05，P < 0.05），而GSK-3β mRNA表達明顯上升（P < 0.05）。見表2。

3.2 3組關(guān)節(jié)軟骨CKI-ε、PGS1、CollagenⅡ蛋白表達水平比較 與空白對照組比較，模型對照組關(guān)節(jié)軟骨CKI-ε蛋白表達明顯升高（P < 0.05），而CollagenⅡ、PGS1蛋白表達明顯降低（P < 0.05，P < 0.01）;與模型對照組比較，跳骨片組關(guān)節(jié)軟骨CKIε蛋白表達明顯降低（P < 0.05），CollagenⅡ、PGS1蛋白表達明顯升高（P < 0.01，P > 0.05）。見表3。

3.3 3組關(guān)節(jié)軟骨的Masson染色 空白對照組和跳骨片組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)清晰，軟骨細(xì)胞密集，軟骨層染色明顯，軟骨組織呈藍綠色，膠原含量較高。模型對照組軟骨層結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨表面粗糙，有裂隙，染色較淺，膠原含量低。

4 討 論

OA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，其病在筋骨，病位在肝腎。肝藏血，主筋;腎藏筋，主骨;老年肝邪，邪滯膝部，氣滯血瘀，經(jīng)絡(luò)閉阻;本痿標(biāo)痹為本病的核心病機，肝腎虧虛，筋骨失養(yǎng)而為痿，腠理空虛易感風(fēng)寒濕之邪而為痹[7]?；贠A的病理特點，臨床上提出“治痿、治痹、痿痹同治”的治療理念，因此治當(dāng)以補益肝腎、強筋壯骨為主（治痿），祛風(fēng)通絡(luò)、除濕散寒為輔（治痹）[8]。跳骨片是由馬錢子（制）、冰片、烏藥、狗脊、黃芪等20味中藥制成的糖衣片劑，其中馬錢子（制）、冰片具有抗炎鎮(zhèn)痛功效，三七、土鱉蟲、紅花等具有活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒的作用，冰片、羌活、烏藥等主要有消腫定痛功效。諸藥合用，共奏活血舒筋、祛風(fēng)除濕散寒的功效。

OA微觀病理表現(xiàn)為炎癥因子的大量產(chǎn)生，進一步破壞軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致軟骨退變;因此，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，促進軟骨基質(zhì)合成，已成為治療OA的一種思路。關(guān)節(jié)軟骨是由一種細(xì)胞類型（軟骨細(xì)胞）組成的，并被包封在細(xì)胞外基質(zhì)中的聯(lián)合組織[9]。軟骨細(xì)胞可合成、分泌細(xì)胞外基質(zhì)，而膠原（Ⅱ型占90%以上）和蛋白聚糖是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)主要成分，膠原能構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，蛋白聚糖能夠維持關(guān)節(jié)軟骨良好彈性，軟骨基質(zhì)是軟骨細(xì)胞汲取營養(yǎng)物質(zhì)和傳遞信號的載體，其代謝平衡維持著關(guān)節(jié)軟骨的生物學(xué)性能[10-11]。OA的特征為關(guān)節(jié)軟骨退化，在這個過程中軟骨細(xì)胞發(fā)生進行性凋亡，軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，含量減少，尤其是Ⅱ型膠原和蛋白多糖的減少。

β-catenin是Wnt經(jīng)典信號通路的關(guān)鍵性調(diào)控蛋白，在正常未受刺激的細(xì)胞中無Wnt信號，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin大部分與細(xì)胞膜上鈣黏著蛋白結(jié)合，使之附著于細(xì)胞骨架蛋白肌動蛋白上，介導(dǎo)同型細(xì)胞間黏附[12]。Wnt經(jīng)典信號通路是以Wnt/β-catenin/Tcf為主線的信號通路，在沒有Wnt信號傳導(dǎo)的情況下，活性GSK-3β使β-catenin磷酸化，導(dǎo)致其泛素化和蛋白酶體降解[13]。當(dāng)Wnt信號被激活后，Wnt與Frizzled和LRP5/6結(jié)合，經(jīng)信號傳導(dǎo)給胞質(zhì)蛋白Dsh，Dsh可抑制GSK-3β的活性。CKI-ε是Wnt通路正向調(diào)節(jié)因子，當(dāng)Wnt信號被激活時，Wnt配體中的一些家族成員與相應(yīng)受體結(jié)合可活化CKI-ε，經(jīng)過多次生物信號傳遞過程，最終抑制GSK-3β對β-catenin的磷酸化降解[14]。未磷酸化的β-catenin在胞質(zhì)中聚集達到一定濃度后進入細(xì)胞核，隨后與T細(xì)胞因子（Tcf/Lef）結(jié)合形成β-catenin-Tcf/Lef，β-catenin-Tcf/Lef轉(zhuǎn)錄促進基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等許多靶基因的表達。課題前期研究發(fā)現(xiàn)，跳骨片可上調(diào)大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-4、β-catenin的蛋白表達，降低滑膜中TNF-α、IL-1β、MMP-13等炎癥因子的表達，抑制OA炎癥反應(yīng)[4]。熒光定量PCR、Western blot結(jié)果顯示，跳骨片干預(yù)后，大鼠關(guān)節(jié)軟骨中β-catenin、Frizzled-2、CKI-ε mRNA表達水平明顯下降，GSK-3β?mRNA表達水平明顯上升;與模型對照組比較，空白對照組和跳骨片組的CKI-ε蛋白表達水平下調(diào)，PGS1、Collagen表達水平上調(diào)，提示跳骨片可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進軟骨基質(zhì)的合成。

本研究結(jié)果顯示，跳骨片可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路促進關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達，維護軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)環(huán)境，對關(guān)節(jié)軟骨具有一定的保護作用;然而其具體作用靶點尚未清晰，還需后期深入研究。

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收稿日期：2018-09-07;修回日期：2018-10-29