FGA基因c.104G＞A雜合突變導(dǎo)致的先天性低纖維蛋白原血癥家系的基因分析

蘇正仙 畢曉潔 金先富 張慧斐 姜俊宇 沈波

纖維蛋白原（FIB）是參與機(jī)體止血的關(guān)鍵物質(zhì)，具有多種功能，包括纖維蛋白凝塊的形成、與凝血酶的結(jié)合、介導(dǎo)血小板聚集反應(yīng)等[1]。它存在于血漿中，由肝細(xì)胞分泌，分子質(zhì)量為340kD，是通過(guò)29個(gè)鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵連接的兩組三個(gè)多肽（Aα、Bβ和γ）組成的完全六聚體[2]。六條鏈排列形成三叉結(jié)構(gòu)，通過(guò)由包含兩個(gè)單獨(dú)三螺旋卷曲螺旋區(qū)域的2個(gè)遠(yuǎn)端球形D結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)中心E區(qū)域組成。每條鏈的N末端有助于構(gòu)成中心E區(qū)域，而B(niǎo)β和γ鏈的C末端和卷曲螺旋區(qū)域的一部分形成2個(gè)遠(yuǎn)端球形D結(jié)構(gòu)域[3]。形成FIB的3條多肽鏈（Aα、Bβ 和 γ）分別含有 610、461以及 411個(gè)氨基酸殘基，每條多肽則分別由相對(duì)應(yīng)的不同基因參與編碼翻譯產(chǎn)生[4]。FIB基因缺陷可影響其FIB的表達(dá)，或明顯影響其表達(dá)產(chǎn)物與血小板糖蛋白、血漿凝血酶之間的結(jié)合位點(diǎn)，更有可能影響到FIB單體的聚合及其蛋白的穩(wěn)定性，由此最終導(dǎo)致機(jī)體表現(xiàn)出與出血、凝血相關(guān)的一系列少見(jiàn)的病癥[5-6]。筆者回顧1例遺傳性低纖維蛋白原血癥患者家系的臨床資料，并通過(guò)基因測(cè)序來(lái)對(duì)其家系的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 資料和方法

1.1 一般資料 本例患者來(lái)自浙江臺(tái)州地區(qū)的先天性低纖維蛋白原血癥家系。先證者，男，49歲，患痔瘡、反復(fù)滲血前來(lái)本院就醫(yī)，發(fā)病原因不明。2016年5月患者行凝血功能檢查，結(jié)果FIB為0.68g/L，血常規(guī)顯示為缺鐵性低色素性貧血，且在1個(gè)月后凝血功能復(fù)查時(shí)FIB值仍處于嚴(yán)重低值，結(jié)合D-二聚體與FIB降解產(chǎn)物（FDP）結(jié)果，排除了原發(fā)及繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)后，結(jié)合家系咨詢，初步診斷為先天性低纖維蛋白原血癥。未發(fā)現(xiàn)該患者有腎臟疾病、肝炎肝硬化的發(fā)病歷史；此外其家族內(nèi)部也從未有患腫瘤的病史等。為求進(jìn)一步確診，筆者對(duì)該家系進(jìn)行了基因測(cè)序。其家系圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 先證者家系圖譜

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù)FIB的基因序列設(shè)計(jì)29對(duì)引物[7]，包含F(xiàn)GA、FGB以及FGG基因的所有外顯子及其側(cè)翼序列和啟動(dòng)子區(qū)，并送上海華大基因公司進(jìn)行合成。

1.2.2 標(biāo)本收集 采血前與其家系成員簽署相關(guān)的知情同意書(shū)。采集家系各成員外周靜脈血樣本兩份，一份按照1∶9的比例以0.109mmol/L的枸櫞酸鈉抗凝，行凝血相關(guān)數(shù)據(jù)的檢測(cè)；另一份常規(guī)血清分離，用于DNA的抽提，血樣本放置于-80℃的冰箱中冰凍保存。

1.2.3 凝血功能檢測(cè)與基因測(cè)序 將枸櫞酸鈉抗凝的血樣以3 000r/min離心10min，上層血漿運(yùn)于檢測(cè)APTT、PT、FIB、TT、D-二聚體、FDP（法國(guó) STA-R 全自動(dòng)血凝分析儀以及其配套試劑），F(xiàn)IB抗原含量采用免疫比濁法測(cè)定（雅培c16000全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑）。另將分離出的血清用于肝腎功能檢測(cè)（雅培c16000全自動(dòng)生化分析儀以及其配套試劑）。用采集的全血標(biāo)本進(jìn)行DNA抽提，經(jīng)PCR擴(kuò)增后外送上海華大基因檢測(cè)公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI GenBank中FIB所對(duì)應(yīng)的基因測(cè)序數(shù)據(jù)做最終地比較分析，并用反向測(cè)序予以驗(yàn)證突變位點(diǎn)。

1.2.4 生物信息學(xué)工具 采用Polyphen-2（蛋白質(zhì)ID：P02671）、MutationTaster（蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄本 ID：ENST00000 302053）兩種在線軟件分析FGA基因第2外顯子c.104G＞A的錯(cuò)義突變對(duì)FGA蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。

2 結(jié)果

2.1 肝功能、凝血項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果 先證者家系成員的肝功能項(xiàng)目檢查結(jié)果均顯示處于正常范圍，排除肝臟功能合成障礙引起的FIB缺陷。見(jiàn)表1。

表1 家系成員的檢測(cè)結(jié)果

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果 基因測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2，先證者FIBFGA基因第2外顯子發(fā)生c.104G＞A的堿基雜合點(diǎn)突變（密碼子CGT→CAT），導(dǎo)致Arg16His的雜合突變（16號(hào)精氨酸突變?yōu)榻M氨酸）。先證者的父親在該位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果與先證者一致，除此以外所有其它的基因測(cè)序結(jié)果都顯示為正常。

圖2 先證者FGA基因第2外顯子測(cè)序圖

2.3 生物信息學(xué)結(jié)果 兩種在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致，Pyolphen積分為1，預(yù)測(cè)結(jié)果為“PROBABLY DAMAGING”，MutationTaster積分為 0.9999，預(yù)測(cè)為“disease causing”。

3 討論

FIB是機(jī)體中含量最高的凝血因子，其在血漿中的正常濃度范圍為2.0～4.0g/L[8]。當(dāng)外界創(chuàng)傷等引起血管出血時(shí)，F(xiàn)IB就會(huì)在血漿一系列凝血因子及相關(guān)酶類(lèi)的催化作用中轉(zhuǎn)變成為纖維蛋白，大量纖維蛋白縱橫交叉呈網(wǎng)狀，結(jié)合血小板形成微血栓達(dá)到止血的目的[9]，不同原因?qū)е碌腇IB含量或者活性降低都有可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出凝血功能上的一系列障礙，引起出血難止亦或者纖溶激活障礙導(dǎo)致血栓栓塞，最終可能危及生命。

20世紀(jì)終末期，Terasawa等[10]首次發(fā)現(xiàn)低纖維蛋白原血癥存在的具體基因缺陷-雜合的γCysl53Arg，之后陸續(xù)有文章報(bào)道新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，截止2017年1月人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)已發(fā)現(xiàn)近300個(gè)突變位點(diǎn)，而FGA基因上就存在100多個(gè)突變位點(diǎn)，包括錯(cuò)義/無(wú)義突變、剪切位點(diǎn)突變、小片段缺失等。

遺傳性低纖維蛋白原血癥臨床表現(xiàn)具有較大的異質(zhì)性[11]，嚴(yán)重程度與FIB的突變位點(diǎn)及類(lèi)型相關(guān)，同一突變也有可能有不同臨床表現(xiàn)。Stucki等[12]研究顯示Arg16His突變者無(wú)出血癥狀。而本文研究家系，先證者表現(xiàn)為痔瘡、反復(fù)滲血，F(xiàn)IB為0.68g/L，明顯低于正常水平，基因測(cè)序結(jié)果顯示FGA基因2號(hào)外顯子上存在c.104G＞A的錯(cuò)義突變（密碼子CGT→CAT），即Arg16His的雜合突變。這一突變不僅可以導(dǎo)致FIB被凝血酶酶解時(shí)FPA釋放速度的減慢[13]，更嚴(yán)重的可能是此突變還可引起FIB被酶解過(guò)程中產(chǎn)生FPA總量的異常，凝血過(guò)程中交聯(lián)纖維蛋白產(chǎn)生量因此減少，導(dǎo)致FIB在機(jī)體血漿中的“量”和活性先天性下降的現(xiàn)象，本文推測(cè)導(dǎo)致該突變是導(dǎo)致該家系先證者反復(fù)滲血的主要原因。

綜上所述，本研究明確了FGAArg16His的突變是導(dǎo)致本研究家系遺傳性低纖維蛋白原血癥發(fā)生的分子機(jī)制。但是這其中所蘊(yùn)含的具體機(jī)制則還需要進(jìn)行深入的研究探索，對(duì)造成先天性低纖維蛋白原血癥的分子機(jī)制也同樣需要進(jìn)一步地被闡明。目前，國(guó)內(nèi)在先天性低纖維蛋白原血癥的相關(guān)研究取得了很大的進(jìn)展，隨著檢測(cè)技術(shù)的逐漸進(jìn)步完善，可以通過(guò)分析纖維蛋白溶解曲線、FIB凝固率檢測(cè)等方法[14]較準(zhǔn)確地評(píng)估FIB功能，以此分析突變與疾病之間的關(guān)系[15]。目前該類(lèi)疾病的治療仍以替代治療為主，基因治療是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)[16]。