陜西茯磚茶中優(yōu)勢(shì)Eurotium屬孢子形態(tài)學(xué)分析及其分子鑒定

呂嘉櫪， 雷 晟， 孟雁南

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

茯磚茶屬于中國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵黑茶，是以黑毛茶為原料，經(jīng)過(guò)汽蒸、渥堆、發(fā)花、干燥、包裝等一系列復(fù)雜工藝精制而成，其中發(fā)花是最為關(guān)鍵的工藝[1].其關(guān)鍵技術(shù)是微生物以茶葉為培養(yǎng)基的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程，通過(guò)提供一定的溫度和濕度環(huán)境，促進(jìn)有益微生物——“金花菌”的生長(zhǎng)繁殖，以在茯磚茶中產(chǎn)生大量的肉眼可見(jiàn)的金黃色顆粒，俗稱(chēng)“金花菌”.該菌群是茯磚茶發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)促進(jìn)茯磚茶品質(zhì)的形成和功能性具有極其重要的作用[2].近年來(lái)對(duì)于茯磚茶中微生物的研究，一方面主要集中在成品茯磚茶優(yōu)勢(shì)微生物的分離鑒定方面；另一方面則是茯磚茶在發(fā)花過(guò)程中微生物的研究.研究發(fā)現(xiàn)茯磚茶“發(fā)花”工藝及其品質(zhì)形成是由多種微生物共同參與發(fā)酵的[3]，有茶葉表面存在的微生物，也有后期在加工過(guò)程中自然生長(zhǎng)的，而“金花菌”是茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌群.資料已記載的種群有Eurotiumamstelodami、Eurotiumchevalieri、Eurotiumrepens、Eurotiumcostiforme、Eurotiumrubrum、Eurotiumherbariorum、Eurotiumcristatum、Eurotiuminetrmeidum等[4-15].隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，新的鑒定技術(shù)在食品微生物菌群組成方面的研究發(fā)揮著重要的作用[16-20].為了闡明起源于陜西涇陽(yáng)的茯磚茶中優(yōu)勢(shì)菌群Eurotium屬的種群關(guān)系，本文選取從陜西茯茶產(chǎn)區(qū)采集的10種不同品牌茶樣品中分離純化的7株優(yōu)勢(shì)Eurotium屬的金花菌群，通過(guò)光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對(duì)其孢子進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，并與18S rDNA序列分析結(jié)合，確定其種屬關(guān)系，為Eurotium屬的菌群鑒定提供參考，同時(shí)為陜西茯磚茶中不同地域標(biāo)志性?xún)?yōu)勢(shì)菌群的鑒定提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物室提供，該菌株是從陜西茯茶產(chǎn)區(qū)采集的10種不同品牌茶樣品中分離純化的7株優(yōu)勢(shì)金花菌群，經(jīng)ITS序列鑒定均為Eurotium屬，編號(hào)分別為E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7.

1.1.2 主要培養(yǎng)基成分

(1)察氏培養(yǎng)基(CZ)：蔗糖40 g，NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂20 g，水1 000 mL.

(2)40%蔗糖察氏培養(yǎng)基(CZ40)：蔗糖400 g，NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂20 g，水1 000 mL.

(3)改良察氏培養(yǎng)基(CZG)：蔗糖40 g，硝酸銨3 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 50 g，蒸餾水1 000 mL,pH 6.8±0.2,121 ℃滅菌15 min.

(4)20%蔗糖改良察氏培養(yǎng)基(CZG20)：蔗糖200 g，硝酸銨3 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 50 g，蒸餾水1 000 mL.

(5)40%蔗糖改良察氏培養(yǎng)基(CZG40)：蔗糖400 g，硝酸銨3 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 50 g，蒸餾水1 000 mL.

(6)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水1 000 mL.其做法是先將馬鈴薯洗凈去皮后稱(chēng)取200 g，切成小塊，加水煮爛(煮沸約20～30 min)，用八層紗布過(guò)濾，加熱，再添加15～20 g瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入20 g葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1 000 mL，pH自然，分裝、加塞、包扎、滅菌，備用.

以上培養(yǎng)基滅菌條件均為 121 ℃、15 min.

1.1.3 試劑藥品

DNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒：北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；

18SrDNA通用引物：北京奧維森基因科技有限公司；

NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′；

NS4：5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′；

AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒：AXYGEN公司；

2×Taq PCR MasterMix(含綠染料)：Biomed.

其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.1.4 儀器與設(shè)備

掃描電鏡(PHENOM-PRO，上海飛納科學(xué)儀器有限公司)；離子濺射儀(SBC-12型，北京中科科儀股份有限公司)；測(cè)序儀(3730XL， Applied Biosystems)；PCR儀(2720 thermal cycler型，Applied Biosystems)；板式離心機(jī)(5810R型，Eppendorf)；凝膠成像裝置(JY04S-3C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；電泳儀(JY300C Power Supply，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 7株菌產(chǎn)孢構(gòu)造的顯微觀察

(1)光學(xué)顯微鏡觀察：將7株菌分別以插片法接種于CZ、CZ40、CZG、CZG20、CZG40、PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)7天后，將蓋玻片的一面用無(wú)菌棉球擦拭干凈，另一面滴入石碳酸棉蘭染色液，觀察菌株的有性和無(wú)性產(chǎn)孢構(gòu)造特征.

(2)掃描電鏡觀察：分別取少許7株的菌體，置于2.5%戊二醛溶液中固定2 h以上；磷酸緩沖液清洗3次(20 min/次)；置于餓酸中固定2 h；磷酸緩沖液清洗3次(20 min/次)；用乙醇(濃度依次為30%、50%、70%、80%、90%、100%)洗脫三次(20 min/次)；置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥、噴金，掃描電子顯微鏡觀察菌體的閉囊殼、子囊、子囊孢子、分生孢子、分生孢子頭、分生孢子梗等有性和無(wú)性產(chǎn)孢構(gòu)造特征.

1.2.2 7株菌的18S rDNA序列測(cè)定

(1)基因擴(kuò)增及測(cè)序：采用通用引物NS1和NS4擴(kuò)增E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7的18s rDNA區(qū)基因序列，同時(shí)以dH2O做負(fù)對(duì)照.擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min后得PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，并進(jìn)行測(cè)序.

(2)序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建：測(cè)序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)并通過(guò)Blast檢索，獲得與目的基因片段同源性最高的18S rDNA基因序列，用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以自展法(Bootstrap)進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1 000次.

2 結(jié)果與討論

2.1 7株菌的有性孢子形態(tài)學(xué)分析

通過(guò)7株菌的有性孢子形態(tài)學(xué)的掃描電鏡觀察結(jié)果表明，7株菌的有性孢子均為子囊孢子，子囊果為閉囊殼，閉囊殼內(nèi)有大量子囊，每個(gè)子囊內(nèi)有8個(gè)子囊孢子，但7株菌的產(chǎn)孢構(gòu)造有所不同，如下述和圖1所示.

E1閉囊殼結(jié)構(gòu)由絮狀菌絲所包圍，球形，100～170μm，子囊近球形，7～12μm，子囊內(nèi)含8個(gè)子囊孢子，子囊孢子呈雙凸鏡形，2.8～4.4μm×4～5μm，凸面較為平整，具少量小疣，赤道溝寬淺且明顯，寬約為1.2μm，邊緣整齊卷曲，子囊孢子外周和赤道脊部位有排列整齊的小孔.

E2子囊果球形或近球形，黃色，處于具飾菌絲網(wǎng)中，70～200μm，內(nèi)部包裹著具擬薄壁組織的子囊，球形至近球形，6～10μm，子囊內(nèi)含8個(gè)子囊孢子，子囊孢子雙凸鏡形，凸面粗糙具小疣，孢子大小4～5μm×5～6μm，具兩個(gè)明顯的縱向雞冠狀突起，寬約0.8～1μm，邊緣不整，較為卷曲.

E3閉囊殼為球形或近球形，100～180μm(240μm)，子囊球形，9～11μm，子囊孢子雙凸鏡形，有明顯的縱向雞冠狀突起，孢子大小4～5μm×5～6μm，凸面粗糙，具尖疣，赤道溝明顯，較淺，邊緣稍卷曲，寬約0.6μm.

E4閉囊殼球形，85～160μm，子囊近球形，9～11μm，子囊孢子呈兩瓣?duì)睿?～5.2μm×4.5～5.6μm，赤道部分具兩個(gè)明顯的、有時(shí)稍彎曲的雞冠狀突起，孢子呈凸透鏡狀，凸面粗糙具小疣，赤道溝約0.6μm，附近有排列整齊的小孔.

E5閉囊殼球形或近球形，直徑80～201μm，裸露，黃色，子囊近球形，7～9μm，子囊孢子呈雙凸鏡形，3.5～4.5μm×4～5μm，孢子兩瓣中間具溝，寬約1.2μm，邊緣較為整齊卷曲，凸面較為粗糙，邊緣和赤道溝內(nèi)部具有排列整齊的小孔.

E6閉囊殼球形或近球形，100～150μm，閉囊殼裸露，子囊球形或近球形，7～10μm，內(nèi)部包裹著8個(gè)子囊孢子，子囊孢子雙凸鏡形，4.5～5μm×5～6μm，有兩個(gè)明顯的“赤道”冠，寬約0.6μm，邊緣不整，凸面有不規(guī)則網(wǎng)結(jié)狀的肋狀突起.

E7閉囊殼由菌絲纏繞形成，為球形或近球形，100～180μm，黃色，子囊球形，或近球形，8～11μm，子囊孢子雙凸鏡形，5～5.8μm×5.3～6.4μm，具兩個(gè)明顯的赤道冠，寬約0.6μm，凸面粗糙具小疣.

(a)、(b)、(c) 分別為掃描電子顯微鏡下的子囊果、子囊果釋放子囊孢子、子囊孢子圖1 E1～E7菌株的有性產(chǎn)孢構(gòu)造

2.2 7株菌的無(wú)性孢子形態(tài)學(xué)分析

通過(guò)7株菌的無(wú)性產(chǎn)孢構(gòu)造的光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察結(jié)果表明，無(wú)性孢子為分生孢子，分生孢子頭為層狀放射狀結(jié)構(gòu)，7株菌的產(chǎn)孢構(gòu)造不盡相同，分述如下.

E1分生孢子梗壁光滑，梗直徑約7.2～11×80～150μm，分生孢子頭拖把型，頂囊為燒瓶形或球形，20～40μm，頂囊次生梗單層，瓶狀梗，2.2～3.6×2.5～7μm，從瓶梗處串生出分生孢子，分生孢子橢圓形或腰鼓型，2.4～3.5×2.9～4μm，壁粗糙,如圖2所示.

(a)光鏡下的分生孢子頭 (b)電鏡下的分生孢子頭 (c)電鏡下的分生孢子圖2 E1菌株的無(wú)性產(chǎn)孢構(gòu)造

E2分生孢子梗壁光滑，5～9×125～225μm，分生孢子頭灰綠色，幼時(shí)球形，老熟后疏松放射型，頂囊燒瓶形或球形，12～25μm，頂囊次生梗單層，瓶梗2.2～3.2×5～6.4μm，分生孢子由瓶梗處串生，分生孢子橢圓形或腰鼓型，4～4.8×3.2～4μm，壁粗糙，如圖3所示.

(a)光鏡下的分生孢子頭 (b)電鏡下的分生孢子頭 (c)電鏡下的分生孢子圖3 E2菌株的無(wú)性產(chǎn)孢構(gòu)造

E3分生孢子梗壁光滑，7.2～11×80～150μm，分生孢子頭初為球形，后呈疏松放射型，頂囊燒瓶形或球形，20～40μm，頂囊次生梗單層，瓶梗2.2～3.6×2.5～7μm，分生孢子由瓶梗處分生出，分生孢子橢圓形或腰鼓型，2.4～3.5×2.9～4μm，壁粗糙，如圖4所示.

(a)光鏡下的分生孢子頭 (b)電鏡下的分生孢子頭 (c)電鏡下的分生孢子圖4 E3菌株的無(wú)性產(chǎn)孢構(gòu)造

E4分生孢子梗壁光滑，7.2～11×80～150μm，分生孢子頭初為球形，后為疏松放射形，頂囊燒瓶形或球形，20～40μm，頂囊次生梗單層，瓶梗2.2～3.6×2.5～7μm，分生孢子由瓶梗處分生出，分生孢子橢圓形或腰鼓型，2.4～3.5×2.9～4μm，壁粗糙，如圖5所示.

(a)光鏡下的分生孢子頭 (b)電鏡下的分生孢子頭 (c)電鏡下的分生孢子.圖5 E4菌株的無(wú)性產(chǎn)孢構(gòu)造

E5無(wú)性產(chǎn)孢形態(tài)與E1基本相同，分生孢子梗壁光滑，2.5～11μm；分生孢子頭初為球形，后呈輻射型或疏松短柱型，頂囊燒瓶形，13～35μm，分生孢子為圓球形，壁具小刺，30～90μm，頂囊次生梗單層，瓶梗1.5～2.5×2.5～4μm，分生孢子為圓球形，近球形，2.5～4μm，壁粗糙具小刺，如圖6所示.

(a)光鏡下的分生孢子頭 (b)電鏡下的分生孢子頭 (c)電鏡下的分生孢子圖6 E5菌株的無(wú)性產(chǎn)孢構(gòu)造

E6分生孢子梗壁光滑，7.2～11×80～150μm，分生孢子頭輻射型，頂囊燒瓶形或球形，20～30μm，頂囊次生梗單層，瓶梗6.5～8.0×3.0～4.0μm，分生孢子由瓶梗處分生出，分生孢子橢圓形或腰鼓型，3.5～6.0×2.9～4μm，壁粗糙具瘤狀突起，如圖7所示.

(a)光鏡下的分生孢子頭 (b)電鏡下的分生孢子頭 (c)電鏡下的分生孢子圖7 E6菌株的無(wú)性產(chǎn)孢構(gòu)造

E7分生孢子梗壁光滑，7.2～11×80～150μm，分生孢子頭疏松放射型，頂囊稍膨大或燒瓶形，20～40μm，頂囊次生梗單層，2.2～3.6×2.5～7μm，分生孢子由瓶梗處分生出，分生孢子橢圓形或腰鼓型，2.0～2.5×2.5～3μm，壁粗糙，如圖8所示.

(a)光鏡下的分生孢子頭 (b)電鏡下的分生孢子頭 (c)電鏡下的分生孢子圖8 E7菌株的無(wú)性產(chǎn)孢構(gòu)造

通過(guò)光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對(duì)7株菌的有性和無(wú)性孢子形態(tài)學(xué)觀察與分析，并與相關(guān)鑒定手冊(cè)和文獻(xiàn)[21-23]中的描述進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明7株菌的種群關(guān)系分別為Eurotium屬的Eurotiumchevalieri(謝瓦散囊菌，E1)、Eurotiumcristatum(冠突散囊菌，E2、E3、E4、E7)、Eurotiumamstelodami(阿姆斯特丹散囊菌，E5)、Eurotiumcostiforme(肋散囊菌，E6).

2.3 7株菌的18S rDNA序列分析

在7株菌孢子形態(tài)學(xué)觀察與分析的基礎(chǔ)上，從分子核酸水平對(duì)其差異進(jìn)行進(jìn)一步分析研究.選取18S rDNA區(qū)域進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)目的條帶進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖9所示.結(jié)果顯示7株菌中E1的18 s大小約為1 000 bp，E2 到E7 約為1 500 bp.

圖9 E1～E 7菌株的18S rDNA PCR 產(chǎn)物電泳圖

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下所示.通過(guò)MEGA系統(tǒng)Align selected block by clustalW分析發(fā)現(xiàn)，E1、E3、E4、E5、E6、E7序列除了首尾序列存在差異之外，其余序列與E4序列一致.其中E2序列與其他6株菌的序列差別較大，E5、E6、E7序列一致.將其基因序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Nucleotide blast比對(duì)及同源性搜索，結(jié)果見(jiàn)表1.E1序列長(zhǎng)度(Query Length)972 bp，E2序列長(zhǎng)度為1629 bp，E3序列長(zhǎng)度961 bp，E4序列長(zhǎng)度944 bp，E5、E6、E7序列長(zhǎng)度均為969 bp.雖然7株菌的序列不完全相同，但均與表1中所列的多種菌有超過(guò)99%的相似性.因此，7株菌鑒定結(jié)果應(yīng)為Aspergillusglaucus、Eurotiumherbariorum、Aspergilluspseudoglaucus、Aspergilluscristatus、Eurotiumchevalieri、Eurotiumamstelodami、Eurotiumrubrum、Aspergillusamstelodami其中之一.依據(jù)最新國(guó)際命名法規(guī)[24]，散囊菌屬和曲霉屬曲霉組是1個(gè)單系的類(lèi)群，7株菌也可為Eurotium或Aspergillus，在這種情況下，應(yīng)依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果.應(yīng)用MEGA5軟件中Phylogeny程序，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖10所示.

表1 7株菌的18S rDNA序列比對(duì)結(jié)果

圖10 基于18S rDNA序列構(gòu)建 的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論

茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)“金花菌”是評(píng)價(jià)其產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)，也是茯茶地理品牌標(biāo)志的重要特征.因此，對(duì)其中種群及其特性的分析與研究具有重要的理論意義及實(shí)用價(jià)值.茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)“金花菌”為Eurotium屬的不同菌群，這些菌群在不同茯磚茶品質(zhì)形成中起著重要作用.

本文通過(guò)對(duì)來(lái)自陜西茯茶產(chǎn)區(qū)的10種不同品牌茶樣品中分離純化的7株Eurotium屬的優(yōu)勢(shì)金花菌的有性和無(wú)性孢子的形態(tài)學(xué)分析，結(jié)合分子生物學(xué)的18S rRNA序列分析，并與手冊(cè)和文獻(xiàn)[21-23]中的描述與檢索表對(duì)照分析，以及最新國(guó)際命名法規(guī)[24]，7株菌的種群關(guān)系分別為Eurotium屬的Eurotiumchevalieri(E1)、Eurotiumcristatum(E2、E3、E4、E7)、Eurotiumamstelodami(E5)、Eurotiumcostiforme(E6).7株菌同屬于散囊菌屬或曲霉屬.

目前，相關(guān)霉菌種屬關(guān)系鑒定方面的研究除了形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)中的ITS、18SrRNA等以外，還有對(duì)NRPS、MLST等[25,26]的差異分析，也有研究者[9,27,28]利用轉(zhuǎn)錄組水平的多基因系統(tǒng)發(fā)育，分析菌株的種屬關(guān)系，但這些研究目前均有一定偏差.因此，Eurotium屬種群關(guān)系的鑒定尚需進(jìn)一步研究.