鮑芹低值部位乙醇提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià)

尤常清 畢玉平 于金慧 馬德源 黃超 尤升波

摘要：為探索鮑芹低值部位高值化利用的途徑及科學(xué)依據(jù)，本試驗(yàn)對(duì)外圍葉柄和根中的物質(zhì)進(jìn)行提取，同時(shí)測(cè)定了該乙醇提取物中總酚和總黃酮含量與抗氧化指標(biāo)總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力、總還原力，并對(duì)各測(cè)定指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：葉柄提取物中總酚含量為92.69 mg GAE/g，總黃酮含量為2.60 mg RE/g;根部提取物總酚含量為145.41 mg GAE/g，總黃酮含量為5.91 mg RE/g。在同等質(zhì)量濃度條件孵育150 min后，鮑芹葉柄和根提取物中總抗氧化能力可達(dá)到BHT的65%以上;二者DPPH自由基清除能力可達(dá)到BHT的57.1%以上;二者亞鐵離子螯合能力可達(dá)EDTA的74.3%～84.0%;二者的還原力較小，僅能達(dá)到BHT的7%～10%。相關(guān)性分析表明抗氧化活性與總酚和總黃酮含量極顯著正相關(guān)。綜合分析可知，鮑芹低值部位具有較好的抗氧化能力。

關(guān)鍵詞：鮑芹;抗氧化能力;總酚;總黃酮

中圖分類號(hào)：S636.301文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）02-0033-07

Assessment on Antioxidant Activity of Alcohol Extract from

Low-Value Parts of Apium graveolens Bao Qin

You Changqing??Bi Yuping??Yu Jinhui??Ma Deyuan??Huang Chao??You Shengbo2

（1. College of Life Sciences， Shihezi University， Shihezi 832003， China;

2. Biotechnology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China）

AbstractIn order to find the methods and scientific bases for high-value utilization of low-value parts of Apium graveolens cultivar Bao Qin， the outer petiole and root were extracted by alcohol， and then the contents of total polyphenols and total flavonoids in the extract were determined. The total antioxidant activity， DPPH radical scavenging， ferrous ion chelating ability and reducing power were used to evaluate its antioxidant activity， and the correlation between the content of polyphenols and flavonoids and the antioxidant activity was also analyzed. The results showed that the content of total polyphenols and total flavonoids was 92.69 mg GAE/g and 2.60 mg RE/g in the outer petiole respectively and 145.41 mg GAE/g and 5.91 mg RE/g in roots respectively. The extracts of outer petiole and root of Bao Qin had better antioxidant activity. Under the same concentration， the total antioxidant activity of the extract of the two parts was up to 65% of the BHT; the DPPH radical scavenging capacity was up to 57.1% of the BHT; the ferrous ion chelating ability was up to 74.3%～84.0% of the EDTA; and the reduce capacity was weak and only 7%～10% of the BHT. The content of total flavonoids and polyphenols had significant correlations with the indicators of antioxidant activity. In conclusion， the low-value parts of Bao Qin such as the outer petiole and roots had higher antioxidant ability.

KeywordsBao Qin; Antioxidant activity; Total polyphenols; Total flavones

自由基是一種普遍存在于生物體內(nèi)的游離基，按其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為半醌類自由基、氧中心自由基和其它類型自由基。隨著對(duì)自由基與疾病關(guān)系認(rèn)知的深入，Ahmadinejad等[1]發(fā)現(xiàn)自由基與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它會(huì)造成生物膜的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，引起酶、氨基酸、蛋白質(zhì)的氧化破壞，對(duì)內(nèi)臟器官、免疫系統(tǒng)的形態(tài)功能產(chǎn)生影響，進(jìn)而引起機(jī)體疾病[1]?？寡趸煞帜軌蚯宄龣C(jī)體過(guò)量自由基，因此，從天然生物中尋找植物源抗氧化劑成為現(xiàn)代保健、醫(yī)藥等行業(yè)的熱點(diǎn)課題之一[2-5]。

目前，科研人員已在蔬果、作物、中草藥[3-5]等植物的抗氧化活性成分方面開(kāi)展大量研究。芹菜作為藥食同源的一種蔬菜，具有很好的保健價(jià)值。研究表明，芹菜葉內(nèi)黃酮含量最高，根中最低，各部位均具有較好的抗氧化能力，且與總黃酮含量顯著正相關(guān)[6，7]。鮑芹因其色澤翠綠、莖柄充實(shí)肥嫩、入口香脆微甘、芹芯生食無(wú)絲無(wú)渣、芹香濃郁等特點(diǎn)倍受消費(fèi)者青睞，已被列為山東省地理標(biāo)志產(chǎn)品。但其絕大部分只作為鮮蔬供應(yīng)，僅心部莖稈市場(chǎng)價(jià)值較高，外圍莖稈和根部的附加值低，綜合利用不夠充分，甚至廢棄，這不僅影響農(nóng)民收益，也污染當(dāng)?shù)丨h(huán)境。因此，本試驗(yàn)以鮑芹外圍葉柄和根為研究對(duì)象，對(duì)其總黃酮、總酚及抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期尋找其高值化利用的科學(xué)依據(jù)，并為提升芹菜相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展空間和拉長(zhǎng)產(chǎn)業(yè)鏈提供思路和借鑒。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為鮑芹外圍葉柄與根（均為廢棄部分），于2016年12月份采自山東省章丘市辛寨鄉(xiāng)鮑家村。樣品經(jīng)干燥、粉碎、過(guò)篩處理后置陰涼干燥處儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?017年5—12月份完成后續(xù)試驗(yàn)。

1.2試劑與儀器

主要試劑為乙醇、亞硝酸鈉、三氯化鋁、氫氧化鈉、硫酸、磷酸鈉、鉬酸銨、氯化亞鐵、EDTA、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;福林酚（Folin-Ciocalteu）、沒(méi)食子酸和蘆丁購(gòu)自上海阿拉丁有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）和菲洛嗪購(gòu)自Sigma-Aldrich。

儀器設(shè)備有電子天平（JA5003，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、超聲清洗儀（SB25-12 DTD，寧波新芝生物技術(shù)有限公司）、水浴鍋（DK-S24，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、純水儀[FYY（40-120）01/02，青島富勒姆科技有限公司]、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE100-Pro，北京大龍）、干燥箱（DHG-9030A，浙江賽德儀器設(shè)備有限公司）、紫外分光光度計(jì)（756PC，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1提取物的制備將鮑芹外圍葉柄和根切成碎塊并于50℃烘干，用粉碎機(jī)打碎，過(guò)69 μm篩得葉柄與根粉末樣品。分別取粉末25 g各3份，于具塞磨口三角燒瓶中加入70%乙醇250 mL，采用超聲輔助提取的方式，浸泡30 min后超聲萃取兩次，每次15 min。過(guò)濾得上清液，固體物料繼續(xù)按照相同方式提取兩次，合并三次上清液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60℃將上清液旋干，并使用干燥箱低溫烘至恒重。記錄提取物重量，計(jì)算提取得率。提取物干燥保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｊ褂们疤崛∥镉?0%乙醇溶液配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL母液，再稀釋到所需質(zhì)量濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）的樣品溶液。

1.3.2總酚與總黃酮含量的測(cè)定總酚含量測(cè)定采用Folin-Ciocalteu方法[8]，并略加改動(dòng)。取0.5 mL樣品溶液，加入0.5 mL蒸餾水和2 mL Folin-Ciocalteu試劑（稀釋10倍，現(xiàn)用現(xiàn)配），混勻后反應(yīng)5 min。加入7.5%的碳酸鈉溶液（w/v）2.0 mL，黑暗條件下25℃室溫反應(yīng)30 min。于765 nm測(cè)定吸光度值，以沒(méi)食子酸（galic acid equivalent， GAE）為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，提取物總酚含量以mg GAE/g表示。

總黃酮含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]的方法。將0.5 mL樣品溶液加入到4.5 mL蒸餾水中， 然后加入5%的亞硝酸鈉溶液（w/v）1 mL，充分混勻后靜置5 min，加入10%的三氯化鋁（w/v）1 mL，混勻后25℃水浴6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，最后補(bǔ)足蒸餾水至25 mL，充分混勻放置15 min。于510 nm測(cè)定吸光度值，以蘆丁（rutin equivalent， RE）為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同提取物總黃酮含量以mg RE/g表示。

1.3.3抗氧化能力評(píng)價(jià)采用鉬酸銨法[8]對(duì)樣品的總抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。分別取1.0 mL不同質(zhì)量濃度梯度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）的鮑芹根和外圍葉柄提取物溶液，置10 mL試管中，加入3.0 mL反應(yīng)液（由0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L鉬酸銨組成），充分混勻后于95℃水浴鍋中分別加熱30、60、90、120、150 min，冷卻至室溫，以蒸餾水為空白，于695 nm處測(cè)定其吸光度。分別選擇0.25、0.50 mg/mL BHT作為對(duì)照。

DPPH自由基清除能力測(cè)定參考文獻(xiàn)[10] 的方法，并略作改動(dòng)。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度梯度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）的鮑芹根和外圍葉柄提取物溶液，置5 mL離心管中，加入0.008 mmol/L的DPPH溶液3.0 mL，室溫避光反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇為空白，于517 nm處測(cè)定吸光度。分別選擇0.25、0.50 mg/mL BHT作為對(duì)照。按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）=A0-（As-Ac）/A0×100。

式中，A0為1.0 mL蒸餾水+3.0 mL DPPH溶液的吸光度;As為1.0 mL樣品溶液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度;Ac為1.0 mL樣品溶液+3.0 mL無(wú)水乙醇的吸光度。

亞鐵離子螯合能力測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]的方法。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度梯度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）的鮑芹根和外圍葉柄提取物溶液，加入3.7 mL蒸餾水混勻后，再加入2 mmol/L FeCl2溶液0.1 mL和5 mmol/L的菲洛嗪溶液0.2 mL，于25℃水浴靜置10 min，以蒸餾水為空白，于562 nm處測(cè)定吸光度。選擇0.25、0.50 mg/mL EDTA作為陽(yáng)性對(duì)照。樣品對(duì)Fe2+的螯合率計(jì)算公式如下：

Fe2+螯合率=[1-（A1-A2）/A0]×100%。

式中，A0為1 mL蒸餾水代替反應(yīng)體系中樣品溶液后的吸光度;A1為樣品溶液反應(yīng)后的吸光度;A2為0.2 mL的蒸餾水代替反應(yīng)體系中菲洛嗪溶液后的吸光度。

總還原力測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]的方法。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度梯度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）的鮑芹根和外圍葉柄提取物溶液，加入0.2 mL/L的磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）2.5 mL和1%的鐵氰化鉀溶液（w/v）2.5 mL，混勻后將混合物于50℃水浴保溫20 min，然后加入10%三氯乙酸溶液（w/v）2.5 mL，混合溶液于3 000 r/min離心10 min，準(zhǔn)確吸取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵溶液（w/v）0.5 mL。以蒸餾水為空白，于700 nm處測(cè)定吸光度，以0.25、0.50 mg/mL BHT作為對(duì)照。

1.4數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，各處理均進(jìn)行3次重復(fù)。采用SPSS 16.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)，采用LSD進(jìn)行多重比較（P<0.05）。采用SPSS 16.0多元線性回歸進(jìn)行總酚、總黃酮與各抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性分析，根據(jù)Pearsons相關(guān)分析結(jié)果判斷其顯著水平（P<0.01或P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1提取得率

采用70%乙醇提取鮑芹葉柄粉和根粉，分別得到28.35%和29.82%的醇提物。用70%乙醇配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的樣品溶液，用于后續(xù)指標(biāo)的測(cè)定。

2.2鮑芹提取物中總酚和總黃酮類化合物含量

由圖1可知，鮑芹根部提取物總酚和總黃酮

含量均顯著大于葉柄提取物（P<0.05）。其中，根部提取物的總酚含量為145.41 mg GAE/g，總黃酮含量為5.91 mg RE/g ;葉柄提取物中的總酚含量為92.69 mg GAE/g，總黃酮含量為2.60 mg RE/g。

2.3抗氧化能力評(píng)價(jià)

2.3.1總抗氧化能力由圖2可以看出，鮑芹根和葉柄提取物均具有較好的總抗氧化能力，其中根提取物的抗氧化效果強(qiáng)于葉柄提取物。隨濃度梯度的增加和孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種提取物的總抗氧化能力也相應(yīng)提高。在孵育150 min條件下，同等濃度的根和葉柄提取物溶液的總抗氧化能力達(dá)到BHT的65%以上。

2.3.2DPPH自由基清除能力由圖3可知，隨濃度的增加，鮑芹根和葉柄提取物的DPPH自由基清除能力明顯增加。在濃度高于1.00 mg/mL后趨于平穩(wěn)，此時(shí)根提取物的DPPH自由基清除能力達(dá)到83%以上，葉柄提取物達(dá)到75%以上。根提取物的清除效果在0.50、1.00 mg/mL時(shí)強(qiáng)于葉柄提取物，在2.00～4.00 mg/mL時(shí)二者的清除能力相當(dāng)。在0.50 mg/mL濃度條件下，鮑芹根和葉柄提取物的DPPH自由基清除能力達(dá)到BHT的67.4%和57.1%，顯著低于對(duì)照。

2.3.3亞鐵離子螯合能力鮑芹根和葉柄提取物的亞鐵離子螯合能力如圖4所示。二者在0.25 mg/mL濃度下亞鐵離子螯合率均在80%以上，并隨濃度增加而下降，到1.00 mg/mL時(shí)最低（68%以上），之后又有所增加?？傮w來(lái)看二者的亞鐵離子螯合能力沒(méi)有明顯的濃度梯度效應(yīng)。在同等濃度條件下，可達(dá)EDTA亞鐵離子螯合能力的74.3%～84.0%。

2.3.4總還原力由圖5可以看出，鮑芹根提取物和葉柄提取物均具有一定的還原力，且呈明顯的濃度梯度效應(yīng)?？傮w上，鮑芹根提取物的還原力大于外圍葉柄，但二者都顯著低于同等濃度條件下BHT的還原力。鮑芹根提取物能達(dá)到BHT的9%～10%，葉柄提取物僅能達(dá)到BHT的7%～9%。

2.4鮑芹提取物中總酚和總黃酮類化合物含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析

由表2可知，總酚和總黃酮含量均與DPPH自由基清除能力、總抗氧化能力和總還原力呈極顯著正相關(guān)。說(shuō)明鮑芹根和外圍葉柄提取物的抗氧化活性可能取決于所含總酚和總黃酮的含量。

3討論

體外化學(xué)評(píng)價(jià)法評(píng)價(jià)樣品的抗氧化性有多種指標(biāo)，僅用一種指標(biāo)難以說(shuō)明問(wèn)題，通常是選擇多種抗氧化指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[13，14]。總抗氧化能力是通過(guò)檢測(cè)提取物溶液的吸光度值變化進(jìn)行評(píng)價(jià)。樣品中的抗氧化成分可將六價(jià)鉬Mo （Ⅵ） 還原為五價(jià)鉬 Mo（Ⅴ），在酸性條件下形成藍(lán)色的Mo （Ⅴ）與磷酸的復(fù)合物，抗氧化能力越強(qiáng)，顏色越深，吸光度值越大。DPPH自由基有單電子，在517 nm處有一強(qiáng)吸收，利用其醇溶液呈紫色的特性，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，因與其單電子配對(duì)，其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速定量分析，清除率越大表明抗氧化能力越強(qiáng)。還原力的測(cè)定實(shí)質(zhì)上是檢驗(yàn)物質(zhì)是否為良好的電子供應(yīng)者，還原力強(qiáng)的物質(zhì)供應(yīng)的電子除可以還原氧化性物質(zhì)外，也可與自由基反應(yīng)，使自由基形成穩(wěn)定的物質(zhì)[15]。本試驗(yàn)選取總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力和還原力等抗氧化指標(biāo)來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)，同等濃度條件下，芹菜根與外圍葉柄提取物的大部分指標(biāo)（總抗氧化能力、DPPH自由基清除活性、亞鐵離子螯合能力）可達(dá)對(duì)照的57%以上，說(shuō)明鮑芹低值部位提取物具有較好的抗氧化活性，有待于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

酚類及黃酮類化合物是天然產(chǎn)物中廣泛存在的一類對(duì)人體健康有益的物質(zhì)，諸多有關(guān)抗氧化相關(guān)的研究表明這兩種成分是天然抗氧化有效成分[16]。本試驗(yàn)測(cè)得鮑芹根部和外圍葉柄提取物的總酚和總黃酮含量分別為145.41 mg GAE/g、5.91 mg RE/g和 92.69 mg GAE/g、2.60 mg RE/g，并且根部提取物總黃酮含量顯著高于新疆地區(qū)不同芹菜品種中含量（最大為0.85 mg RE/g）[17]。進(jìn)一步分析可知鮑芹根部提取物的總酚和總黃酮含量顯著高于外圍葉柄提取物，這與張桂等[18]的研究結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)通過(guò)相關(guān)性分析表明，不同部位提取物的抗氧化能力與總酚和總黃酮含量顯著相關(guān)，說(shuō)明可能是此類成分發(fā)揮抗氧化功能。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高，人們對(duì)于功能性產(chǎn)品的需求也越來(lái)越大。當(dāng)前，我國(guó)的功能性食品原輔料主要來(lái)源于中草藥材（包括藥食兩用材料和功能性食品中可使用的藥材）、食品原料（普通食品原料、新食品原料和食品添加劑）、部分天然產(chǎn)物和動(dòng)植物提取物[19]。芹菜是大眾喜愛(ài)的菜品之一，來(lái)源充足，價(jià)格合理。芹菜中含有芹菜素、苯丙素類化合物、香豆素類化合物和揮發(fā)油等成分，具有降血壓、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生理活性[20-23]。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上芹菜產(chǎn)品主要以芹菜粉、芹菜混合發(fā)酵汁等初級(jí)加工品為主。鮑芹也是以初級(jí)加工產(chǎn)品為主，且外圍葉柄和根多被廢棄。因此，以鮑芹為材料，開(kāi)展抗氧化活性方面的研究，對(duì)于延伸農(nóng)產(chǎn)品深加工產(chǎn)業(yè)鏈，提高相關(guān)產(chǎn)業(yè)的附加值，推動(dòng)農(nóng)產(chǎn)品精深加工具有重要意義。本研究?jī)H對(duì)乙醇粗提物的抗氧化活性進(jìn)行初步研究，還需明確其發(fā)揮作用的主要部位或成分。此外，本試驗(yàn)提取方式剩余殘?jiān)亢艽螅覀冋谔剿鞑㈤_(kāi)展微生物發(fā)酵的方式，期待為徹底解決環(huán)境污染問(wèn)題提供合適的方法。

4結(jié)論

綜合分析可知，鮑芹外圍葉柄和根部的乙醇提取物均具有較好的抗氧化活性，黃酮和多酚類化合物可能是其發(fā)揮抗氧化效果的主要成分。因此，鮑芹低值或廢棄部位含有高附加值成分，可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)以提高鮑芹產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值。

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